Producción de ácido mucónico a partir de glucosa y xilosa en Pseudomonas putida mediante evolución e ingeniería metabólica

Nature Communications volumen 13, Número de artículo: 4925 (2022) Citar este artículo

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El ácido mucónico es una molécula bioprivilegiada que se puede convertir en productos químicos de reemplazo directo para los productos petroquímicos establecidos y los bioproductos con rendimiento mejorado. En este estudio, Pseudomonas putida KT2440 está diseñada para convertir la glucosa y la xilosa, los carbohidratos principales en los hidrolizados lignocelulósicos, en ácido mucónico utilizando una estrategia guiada por modelos para maximizar el rendimiento teórico. Utilizando la evolución de laboratorio adaptativa (ALE) y la ingeniería metabólica en una cepa diseñada para expresar la vía de la D-xilosa isomerasa, demostramos que las mutaciones en el simportador heterólogo D-xilosa:H+ (XylE), aumentaron la expresión de un transportador de la superfamilia de facilitadores principales (PP_2569 ), y la sobreexpresión de aroB que codifica la 3-deshidroquinato sintasa nativa, permiten la producción eficiente de ácido mucónico a partir de glucosa y xilosa simultáneamente. Utilizando la cepa diseñada racionalmente, producimos 33,7 g L-1 de muconato a 0,18 g L-1 h-1 y un rendimiento molar del 46 % (92 % del rendimiento teórico máximo). Esta estrategia de ingeniería es prometedora para la producción de otros compuestos derivados de la ruta del shikimato a partir de azúcares lignocelulósicos.

El desarrollo de procesos económicos para la producción de biocombustibles y bioquímicos a partir de la lignocelulosa será fundamental para ayudar a reducir las emisiones antropogénicas de gases de efecto invernadero asociadas al consumo de combustibles fósiles1,2. Entre las diversas áreas del espacio metabólico que se han explorado para la producción bioquímica, las moléculas de las vías catabólicas aromáticas microbianas exhiben una diversidad química sustancial3,4. Cabe destacar que el ácido cis,cis-mucónico (en adelante muconato) es una plataforma química popular de la vía catabólica del catecol que se puede producir a partir de compuestos aromáticos derivados de la lignina, carbohidratos y compuestos aromáticos derivados de plásticos residuales5,6,7,8,9 ,10,11,12. El muconato es una molécula bioprivilegiada13 que se puede convertir en productos químicos de reemplazo directo, como el ácido adípico y el ácido tereftálico5,14,15, o en bioproductos con rendimiento mejorado16,17,18,19,20,21,22,23,24 .

La producción de muconato a partir de carbohidratos se basa en la vía del shikimato para la biosíntesis de aminoácidos aromáticos y se demostró por primera vez en Escherichia coli5 recombinante. La eritrosa-4-fosfato (E4P) y el fosfoenolpiruvato (PEP) se condensan para formar 3-desoxi-d-arabinoheptulosonato 7-fosfato (DAHP), que luego se convierte en 3-deshidroshiquimato (3-DHS), un intermediario clave en la vía del shikimato. A partir de 3-DHS, se han informado al menos cinco vías para la biosíntesis de muconato25,26,27,28,29,30. Entre estas vías, una avanza a través del protocatechuato intermedio (PCA) a través de una 3-DHS deshidratasa (asbF) y da como resultado un rendimiento teórico máximo más alto que las otras, que avanzan a través del shikimato a través de una shikimato deshidrogenasa (aroE) (Fig. 1a )29.

a Esquema de la estrategia general de ingeniería metabólica. Para utilizar xilosa, xylE, d-xilosa isomerasa (xylA), xiluloquinasa (xylB), transaldolasa (tal) y transcetolasa (tkt) de E. coli se expresaron heterólogamente. E4P y PEP se condensaron para formar DAHP a través de una DAHP sintasa resistente a la retroalimentación (aroGD146N)70. Para convertir DAHP en muconato (MA), los genes que codifican una 3-DHS deshidratasa (asbF) de Bacillus cereus y una PCA descarboxilasa (aroY) y su correspondiente proteína generadora de cofactores (ecdB), ambos de Enterobacter cloacae, se analizaron heterólogamente. expresado. aroB y catecol 1,2-dioxigenasa (catA) se sobreexpresaron3,32. Se sobreexpresó una piruvato-liasa de corismato diseñada a partir de E. coli (ubiC-C22)40 para convertir el chorismato (CSA) en 4-hidroxibenzoato (4HB), que se puede convertir en PCA y MA. Los genes eliminados se muestran en rojo. Se eliminó la glucosa deshidrogenasa (gcd) para evitar la formación de xilonato o gluconato. Las isomerasas de glucosa-6-fosfato pgi-1 y pgi-2 se eliminaron previamente3,32, pero pgi-1 se restauró en este estudio. Se eliminó cada una de las piruvato quinasas pykA y pykF para reducir la competencia por PEP. Para acumular MA, se eliminaron pcaHG y catBC para evitar la apertura del anillo de PCA y el catabolismo de MA, respectivamente. P fosfato, 2-KGn 2-cetogluconato, 2-KG-6-P 2-cetogluconato-6-P, G6P glucosa-6-P, 6PG 6-fosfogluconato, KDPG 2-ceto-3-desoxi-6-fosfogluconato, G3P gliceraldehído-3-P, FBP fructosa-1,6-P2, F6P fructosa-6-P, S7P sedoheptulosa-7-P, R5P ribosa-5-P, Ri5P ribulosa-5-P, 3PG 3-fosfoglicerato, CAT catecol, SA shikimate, S3P shikimate-3-fosfato, ICIT isocitrato, CIT citrato, AKG alfa-cetoglutarato, SUCC succinato, FUM fumarato, MAL malato, GLX glioxilato, OAA oxaloacetato, AcCoA acetil-Coenzima A. b Modelado metabólico del máximo rendimientos teóricos molares y de carbono de muconato con o sin pgi-1. Las líneas azules representan la vía asbF, las líneas rojas representan la vía aroE, las líneas continuas representan el % de rendimiento molar y las líneas discontinuas representan el % de rendimiento de carbono. Las áreas grises representan el porcentaje molar de xilosa consumida del 33 al 40% (con el resto de glucosa), imitando la composición de los hidrolizados de rastrojo de maíz. c Cultivos en matraz de agitación de la cepa QP328 en glucosa y xilosa. El % de rendimiento molar se calculó como [mM muconato/mM (glucosa + xilosa) × 100], y el % de rendimiento de carbono se calculó como [mM muconato × 6/mM (glucosa × 6 + xilosa × 5) × 100]. Las barras de error representan la desviación estándar de los triplicados biológicos. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Varios esfuerzos previos para producir muconato a partir de azúcares a través de asbF han interrumpido la vía del shikimato al eliminar aroE10,11,31. La eliminación de aroE da como resultado cepas que son auxotróficas para los aminoácidos aromáticos esenciales, lo que no es deseable para un bioproceso10,25. Recientemente, se han diseñado cepas de Pseudomonas putida KT2440 (en adelante, P. putida) para producir muconato de glucosa a través de asbF3,32,33 de manera eficiente. Más recientemente, informamos sobre la ingeniería de P. putida que logró un título de 22,0 g L−1 a 0,21 g L−1 h−1 y un rendimiento molar del 35,6 % a partir de glucosa en un biorreactor controlado por pH32.

Hasta la fecha, la mayoría de los esfuerzos para producir muconato a partir de carbohidratos han empleado glucosa como sustrato. Sin embargo, la coutilización de glucosa y xilosa, que a menudo son los dos carbohidratos principales en la lignocelulosa2, es crucial para la valorización de los hidrolizados de biomasa. Se ha estudiado la coutilización de glucosa y xilosa para la producción de muconato en Escherichia coli11. En este trabajo previo, la xilosa fue metabolizada al ciclo TCA para evitar la represión de catabolitos de carbono (CCR), limitando así la producción de muconato, lo que motiva el desarrollo de otras estrategias hacia este objetivo. A diferencia de E. coli, P. putida es incapaz de utilizar xilosa de forma nativa, lo que brinda la oportunidad de diseñar vías de xilosa óptimas en ausencia de CCR34,35,36,37.

En este trabajo, buscamos incorporar la utilización de xilosa para lograr una producción eficiente de muconato a partir de glucosa y xilosa en P. putida. Con este fin, primero eliminamos hexR y diseñamos la vía de la D-xilosa isomerasa en una cepa previamente diseñada para producir muconato a partir de glucosa (Tabla 1). Mediante la combinación de modelos metabólicos, ingeniería de cepas racional, evolución de laboratorio adaptativa y cultivo de biorreactores, identificamos estrategias exitosas para mejorar la producción de muconato a partir de glucosa y xilosa. Finalmente, se realiza metabolómica para inferir el impacto de las modificaciones genéticas en el flujo metabólico.

Se consideraron tres vías metabólicas de xilosa para permitir la producción de muconato a partir de este sustrato36, incluida la vía de la isomerasa en la que la xilosa se metaboliza a xilulosa-5-P (X5P) en la vía de las pentosas fosfato (PPP)38, la vía de Weimberg que alimenta xilosa al ciclo TCA a través del α-cetoglutarato38,39, y la vía de Dahms40, que comparte los tres pasos iniciales con la vía de Weimberg, después de lo cual una aldolasa convierte el semialdehído α-cetoglutárico en piruvato y glicolaldehído. Entre estos, la vía de la d-xilosa isomerasa, en la que la xilosa se metaboliza a través de la d-xilosa isomerasa (xylA) y la xiluloquinasa (xylB) a xilulosa-5-fosfato (X5P), es ideal para lograr un alto rendimiento teórico de muconato. ya que X5P puede convertirse aún más en E4P y posteriormente ingresar a la vía del shikimato (Fig. 1a)35. Integramos la ruta de la isomerasa en una cepa previamente diseñada para producir muconato a partir de glucosa, CJ5223, mediante la sobreexpresión de versiones optimizadas de codón de la d-xilosa isomerasa (xylA), la xiluloquinasa (xylB) y el simportador de d-xilosa:H+ de E. coli (xylE), junto con una transaldolasa (tal) y una transcetolasa (tkt) para mejorar el flujo de carbono dentro de la PPP (Fig. 1a)35. También eliminamos hexR, que codifica un regulador transcripcional que controla la expresión de genes importantes para el metabolismo del azúcar, ya que previamente habíamos descubierto que esto mejora la conversión de glucosa en muconato32.

Thompson et al. informó anteriormente que el empleo de las vías asbF y aroE puede ayudar a maximizar la asimilación neta de precursores y el flujo de metabolitos hacia el muconato25. Por lo tanto, se integró una piruvato-liasa de corismato diseñada (ubiC-C22)41 con inhibición del producto aliviado para mejorar la producción de muconato a través de la vía del shikimato a través de aroE (Fig. 1a). Anteriormente habíamos eliminado pgi-1 y pgi-2, que codifican glucosa-6-P isomerasas redundantes, para interrumpir el ciclo EDEMP, una combinación de Entner-Doudoroff, gluconeogénico Embden-Meyerhoff-Pernass y las vías de pentosa fosfato42. El propósito de interrumpir el ciclo de EDEMP es evitar que cicle para generar piruvato independiente de PEP durante el crecimiento en glucosa, lo que podría permitir que la célula redirija el carbono hacia el crecimiento a expensas de la producción de muconato, a pesar de la eliminación de los genes que codifican las piruvato quinasas. (pykA, pykF) y PEP carboxilasa (ppc)3. Esta estrategia es beneficiosa para la producción de muconato a partir de glucosa como única fuente de carbono, pero en este caso, la eliminación de pgi-1 y pgi-2 disminuiría el rendimiento teórico máximo de muconato de las vías de biosíntesis de muconato catalizadas por asbF y aroE cuando la xilosa es convertido a través del PPP (Fig. 1b).

Teniendo en cuenta que la fracción de xilosa en la mezcla de glucosa y xilosa (xilosa/glucosa+% de xilosa, moles) en el hidrolizado de rastrojo de maíz oscila entre el 34 y el 38 % (Fig. 1 complementaria), el modelo predijo el rendimiento teórico máximo de muconato con pgi- 1 y pgi-2 eliminados para ser más bajos que si uno o ambos estuvieran presentes (Fig. 1b). Para probar la hipótesis de que la actividad de glucosa-6-fosfato isomerasa (codificada por pgi-1 y pgi-2) es necesaria para que el flujo de xilosa ingrese al ciclo EDEMP, construimos cepas basadas en JE322635, una cepa derivada de P. putida KT2440 que se diseñó previamente para utilizar xilosa utilizando la vía de la d-xilosa isomerasa, pero por lo demás es de tipo salvaje, generando cepas LC041 (∆pgi-1), LC345 (∆pgi-2), LC347 (∆pgi-1 ∆pgi-2). En el cultivo del lector de placas en medio M9 que contenía xilosa, LC347 no creció, mientras que tanto LC041 como LC345 demostraron tasas de crecimiento reducidas y mayores retrasos en el crecimiento (Fig. 2 complementaria). LC345, con pgi-1 intacto, exhibió una tasa de crecimiento más baja y un retraso de crecimiento más largo en comparación con LC041, que contiene solo pgi-2, lo que sugiere que Pgi-1 contribuye menos a la actividad global de glucosa-6-fosfato isomerasa que Pgi-2. Dado que se esperaría que el ciclo EDEMP compita con la biosíntesis de muconato y reduzca el rendimiento de muconato, restauramos pgi-1 para permitir el flujo de xilosa en el ciclo EDEMP y mejorar el rendimiento teórico máximo, generando la cepa QP328 (Fig. 1a y Tabla 1) .

La cepa QP328 se cultivó en matraces de agitación en una mezcla de glucosa y xilosa para examinar su conversión en muconato. Aunque se ha demostrado que la ruta de la xilosa isomerasa es eficiente en P. putida35 de tipo salvaje, la tasa de utilización de xilosa de QP328, sin embargo, fue muy baja en comparación con la de la glucosa (Fig. 1c). Dado que la glucosa y la xilosa se pueden utilizar simultáneamente en el fondo de tipo salvaje de P. putida KT2440 tras la introducción de la misma ruta de xilosa isomerasa35, planteamos la hipótesis de que en nuestra cepa productora de muconato había un cuello de botella en el transporte o el metabolismo de la xilosa.

Para mejorar la utilización de xilosa por QP328, realizamos ALE mediante pases en serie de la cepa en medio M9 complementado con xilosa 10 mM como única fuente de carbono y energía. A medida que se pasaban las poblaciones, se alcanzaron valores más altos de OD600 más rápidamente. Después de 7 pases (~50 generaciones), los cuatro linajes alcanzaron la turbidez en 2 a 4 días en comparación con los 14 días al comienzo del ALE, y la evolución terminó. Las poblaciones evolucionadas de los cuatro linajes se sembraron en una placa de agar LB y se eligieron tres aislados en cada placa para la preselección en matraz de agitación (12 aislados en total). En la mayoría de los casos, todos los triplicados del mismo linaje exhibieron un crecimiento y una producción de muconato similares, por lo que se asumió que probablemente representaban el mismo genotipo y solo se salvó uno de cada linaje. En el linaje 1, sin embargo, una réplica funcionó de manera diferente, por lo que se guardaron dos aislamientos (Fig. 3 complementaria). Para identificar las mutaciones que pueden contribuir a una mejor utilización de la xilosa, se secuenciaron los genomas de los cinco aislamientos. Los cinco aislamientos tenían mutaciones en el transportador de xilosa xylE (A62V, A62V y A455V, T34I, L214P, S205F, para los aislamientos 1, 2, 3, 4, 5, respectivamente). Cuatro de los aislamientos (1, 3–5) tenían mutaciones que probablemente inactivaron aroG-D146N (cambio de marco +7 pb, cambio de marco +2 pb, M1N y L2H, cambio de marco -16 pb, para aislamiento 1, 3, 4, 5, respectivamente ) (Fig. 2a). Luego se evaluaron los cinco aislamientos en frascos de agitación con glucosa, xilosa y una mezcla de glucosa y xilosa. Como era de esperar, las cepas con mutaciones en aroG-D146N crecieron mejor pero produjeron menos muconato. El aislamiento 2 logró el rendimiento de muconato más alto y el rendimiento de biomasa más bajo, y se denominó QP478 (Fig. 4 complementaria). QP478 demostró un crecimiento sustancialmente mejorado en xilosa en comparación con QP328 en un lector de placas, en el que el crecimiento de QP328 fue insignificante mientras que QP478 alcanzó una DO600 de 0,5 en 72 h (Fig. 2b).

a Mutaciones identificadas en ALE mediante la secuenciación del genoma completo de los cinco aislamientos (el diagrama de Sankey se construyó utilizando la herramienta en línea SankeyMATIC). b Curva de crecimiento de las cepas de ingeniería inversa LC091 y LC100, con la cepa no evolucionada QP328 y la cepa evolucionada QP478 para comparación. μA representa la tasa de crecimiento absoluta y todos los μA presentados aquí son los valores promedio de tres curvas de crecimiento independientes. c Experimentos en matraz de agitación de las cepas LC091 y LC100 modificadas por ingeniería inversa, en comparación con QP478, en medio M9 suplementado con xilosa 30 mM. El rendimiento de LC100 se comparó con LC091 utilizando la prueba t de Student de dos colas (P < 0,0001). d Experimentos en matraces de agitación que comparan las cepas de ingeniería inversa LC091 y LC100 y la cepa evolucionada QP478 en medio M9 suplementado con glucosa 30 mM y xilosa 15 mM. El % de rendimiento molar se calculó como [mM muconato/mM (glucosa + xilosa) × 100], y el % de rendimiento de carbono se calculó como [mM muconato × 6/mM (glucosa × 6 + xilosa × 5) × 100]. Las barras de error aquí representan la desviación estándar de tres réplicas biológicas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Las mutaciones identificadas en QP478 se enumeran en Datos complementarios 1. De ellas, las mutaciones que supusimos que podrían estar relacionadas con el crecimiento mejorado en xilosa incluyeron: (1) dos mutaciones de sentido erróneo en el gen transportador de xilosa, xylE, donde los residuos de alanina se reemplazaron con valinas , A62V y A455V; (2) una mutación puntual G→A 10 pb aguas arriba del elemento −35 de un promotor putativo (Fig. 5 complementaria) predicha por el programa de predicción del promotor BPROM σ7043 aguas arriba de PP_2569, que se anota como una superfamilia facilitadora principal de metabolitos ( MFS) transportador en la base de datos Uniprot; y (3) una región de 227,8 kB del genoma de PP_5050 a PP_5242 que parecía estar duplicada (Fig. 2a).

Para comprender la contribución de las mutaciones que condujeron a un crecimiento mejorado en xilosa durante ALE, creamos cepas que restauraron individualmente las secuencias de tipo salvaje en la cepa evolucionada QP478. Las mutaciones A62V y A455V se restauraron al tipo salvaje por separado en xylE, generando LC093 y LC078, respectivamente. Se restauró la mutación G→A en la región promotora de PP_2569, generando LC061. En los experimentos con lectores de placas, la restauración de xylE-A455V o xylE-A62V provocó una disminución de la tasa de crecimiento y un mayor retraso en el crecimiento de LC078 y LC093, respectivamente (Fig. 6a-c complementaria). La restauración de la mutación G→A en PPP_2569 condujo a una tasa de crecimiento ligeramente menor (Figura complementaria 6a, b). En matraces de agitación, solo LC093 demostró un rendimiento de muconato significativamente menor en comparación con QP478 (Fig. 6f, g, j complementarias), pero las tres cepas LC061, LC078 y LC093 exhibieron un crecimiento y una producción de muconato más lentos (Fig. 6g–j complementaria), lo cual es consistente con los resultados de los experimentos del lector de placas (Fig. 6a-c complementaria). La reducción de la productividad del muconato, causada por la disminución de las tasas de crecimiento y/o el aumento del retraso en el crecimiento, indicó que todas estas mutaciones contribuyeron a mejorar el crecimiento celular en la xilosa de QP478 (Fig. 6 complementaria).

También realizamos el experimento inverso, diseñando las mutaciones ALE en la cepa original QP328 para obtener una cepa diseñada racionalmente que contiene solo mutaciones que contribuyen a mejorar la producción de muconato. Primero hicimos ingeniería inversa de la cepa QP328 no evolucionada con las mutaciones de tres puntos. Las mutaciones A62V y A455V XylE se introdujeron en la cepa no evolucionada QP328, generando LC091. La mutación G→A en PPP_2569 se diseñó en QP328 y LC091, generando LC092 y LC100, respectivamente. Las cepas LC091, LC092 y LC100, junto con QP328 y QP478, se evaluaron en un lector de placas que contenía medio M9 con xilosa 30 mM. Curiosamente, la introducción de las dos mutaciones XylE permitió el crecimiento celular en xilosa en LC091 (Fig. 2b), que exhibió una tasa de crecimiento comparable pero una biomasa final más alta en comparación con QP478 en xilosa sola y en una mezcla de xilosa y glucosa (Fig. 2b). La introducción de la mutación G→A en PPP_2569 a QP328 también permitió el crecimiento celular de LC092 en xilosa, aunque a una tasa mucho más baja en comparación con LC091 (Fig. 2b). Inesperadamente, la introducción de la mutación G→A en PPP_2569 a LC091 condujo a una disminución del crecimiento y una menor biomasa de LC100 tanto en xilosa como en sustratos mixtos (Fig. 2b).

A continuación, evaluamos LC091, LC100 y QP478 en matraces de agitación que contenían medio M9 con xilosa 30 mM. LC091 alcanzó casi el doble del rendimiento de biomasa (OD600) pero logró un rendimiento de muconato más bajo en comparación con QP478 (Fig. 2c). Además, LC100 alcanzó un rendimiento de muconato comparable al de QP478, aunque a un ritmo menor (Fig. 2c). RT-qPCR indicó que la mutación G→A en PPP_2569 aumentó la expresión de PP_2569 (Fig. 7 complementaria). También evaluamos LC091, LC100 y QP478 en medio M9 con una mezcla de glucosa y xilosa. De acuerdo con los resultados de xilosa solamente, el rendimiento de muconato de LC091 es menor que LC100 y QP478 en la mezcla; LC100 todavía exhibió un crecimiento mucho más lento que QP478 en la mezcla, aunque utilizó glucosa y xilosa simultáneamente y alcanzó un rendimiento de muconato comparable (Fig. 2d). La diferencia en estas cepas sugirió que un gen o genes en la región duplicada PP_5050–PP_5242 podrían ser importantes para mejorar el rendimiento de QP478.

La única diferencia genética entre las cepas LC091 y LC100 es la mutación G→A en la región promotora que condujo a una mayor expresión de un supuesto transportador MFS PP_2569 (Fig. 5 complementaria). Para racionalizar cómo podría ocurrir la mutación en ALE y para examinar cómo PP_2569 podría afectar el metabolismo, se realizaron experimentos de metabolómica intracelular y extracelular con LC091 y LC100 cultivados en xilosa. Se analizaron los metabolitos seleccionados de la fase logarítmica temprana, la fase logarítmica media y la fase logarítmica tardía (Fig. 8 complementaria), y las puntuaciones Z se representaron como en la Fig. 3a. En general, observamos que LC091 acumuló más metabolitos tanto en la vía EDEMP como en el ciclo TCA, tanto intracelular como extracelularmente, mientras que LC100 demostró una mayor acumulación de metabolitos relacionados con la vía shikimato (Fig. 3a). Hubo tres excepciones destacadas de compuestos relacionados con la ruta del shikimato que fueron más abundantes en LC091, a saber, l-tirosina, l-fenilalanina y l-triptófano, que son todos aminoácidos aromáticos derivados del corismato (Fig. 3b-d). En Pseudomonas aeruginosa, se informó anteriormente que la l-tirosina y el l-triptófano podrían inhibir fuertemente las DAHP sintasas nativas AroF-1 y AroF-244. Por lo tanto, postulamos que AroF-1 y AroF-2 podrían inhibirse menos en LC100 en comparación con LC091. Aunque una DAHP sintasa resistente a la retroalimentación, aroGD146N, se ha sobreexpresado en nuestras cepas, estudios previos mostraron que las DAHP sintasas nativas AroF-1 y AroF-2 solas condujeron a una producción de PCA y fenol de ~30 % en comparación con la sobreexpresión adicional de aroGD146N, en P. putida45 y Pseudomonas taiwanensis46, respectivamente. Razonamos que la producción mejorada de muconato de LC100 en comparación con LC091 podría deberse a una menor inhibición de AroF-1 y AroF-2 (Fig. 3b-e), y la concentración reducida de PEP y la mayor acumulación de DAHP en LC100 respaldan esta interpretación ( Figura 3a).

un mapa de calor de los metabolitos intracelulares y extracelulares seleccionados. Las puntuaciones Z se calcularon usando las intensidades promedio de los metabolitos intracelulares y extracelulares por separado, y también se incluyó un control de tiempo cero del medio no inoculado para el análisis de metabolitos extracelulares. b–e Intensidades de metabolitos seleccionados de la fase logarítmica tardía, "In" representa intracelular, "Ex" representa extracelular y "ND" representa no detectado. La señal de intensidad intracelular se recolectó utilizando el sedimento celular de un cultivo celular de 1 mL, y la señal de intensidad extracelular se recolectó utilizando 20 μL del sobrenadante correspondiente. f Estructura de XylE (PDB ID: 4GBY)48 con residuos de ubicaciones de mutaciones derivadas de ALE marcadas en verde. La d-xilosa se muestra en barras y bolas negras. g Curva de crecimiento de la cepa LC111 en comparación con JE3692 en medio M9 suplementado con xilosa 30 mM. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Además, una explicación adicional podría ser que PP_2569 puede transportar los aminoácidos aromáticos extracelularmente; sin embargo, no observamos la acumulación extracelular de estos aminoácidos (Fig. 3b-d). En cambio, encontramos una acumulación extracelular sustancial de ácido antranílico en LC100 (Fig. 3e). El ácido antranílico es un precursor del l-triptófano y un producto directo del corismato, que es un nodo importante en la ruta del shikimato del que se derivan todos los aminoácidos aromáticos. Se informó que el corismato es inestable intracelularmente47 y no se detectó en nuestras muestras de metabolómica intracelular. Según los resultados actuales, postulamos que PP_2569 podría exportar ácido antranílico, lo que podría conducir a una disminución de la acumulación intracelular de l-triptófano (Fig. 3d, e). La mayor acumulación de ácido antranílico también puede reducir el flujo de corismato hacia otros aminoácidos aromáticos, lo que lleva a una menor acumulación de L-tirosina y L-fenilalanina en la cepa LC100. Se justifica más trabajo para investigar la base mecánica de esta mutación beneficiosa derivada de ALE.

Por separado, para investigar el mecanismo de las mutaciones en XylE, se etiquetaron en el (PDB ID: 4GBY)48, destacando que todas las mutaciones estaban ubicadas en los dominios transmembrana (Fig. 3f). Anteriormente, Jiang et al. demostraron que la introducción de dos mutaciones (G58W y L315W) en XylE podría evitar la unión de dos inhibidores a través de cambios conformacionales49. En particular, el sitio G58W está en el mismo dominio transmembrana que A62V y cerca de T34I en la estructura. Dado que la cepa LC345 que no produce muconato con XylE de tipo salvaje y antecedentes genéticos similares a QP328 creció bien en xilosa (Fig. 2a complementaria), planteamos la hipótesis de que las mutaciones en XylE que ocurrieron en ALE podrían ser inducidas por inhibidor(es) de la cepa de fondo productora de muconato. También introdujimos las mutaciones xylE-A62V y A455V en la cepa JE3692, que anteriormente se informó que crece en hidrolizados lignocelulósicos, generando LC111. Las dos cepas se evaluaron en un lector de placas en xilosa. LC111 demostró un crecimiento mejorado con un tiempo de retraso reducido y una mayor tasa de crecimiento en comparación con JE3692 (Fig. 3g). La ligera mejora puede deberse a las trazas de inhibidor(es) de las rutas nativas, y esto también puede sugerir que la introducción de xylE-A62V, A455V puede mejorar la utilización de xilosa para la producción de otros productos relacionados con la ruta no shikimato.

La duplicación de 227,8 kB se identificó en función de una cobertura de secuenciación aproximadamente dos veces mayor desde PP_5050 a PP_5242 en comparación con el resto del genoma (Fig. 4a). Sin embargo, fue un desafío identificar la ubicación exacta de la región duplicada en función de los datos de secuenciación debido a la corta longitud de lectura de la secuenciación de Illumina50,51. Por lo tanto, eliminamos la región original de PP_5050–PP_5242 en QP478, usando las secuencias conocidas fuera de la región como brazos homólogos para generar LC171, y eliminamos una parte de la duplicación de PP_5084–PP_5242 para generar la cepa LC173. En xilosa 30 mM en medio M9, LC171 con la eliminación de toda la región exhibió una tasa de crecimiento más baja, mientras que LC173 con eliminación parcial mostró un crecimiento comparable con un retraso de crecimiento ligeramente más largo y una tasa de crecimiento aumentada en relación con QP478 (Fig. 4b). Con base en estos resultados, concluimos que la duplicación es importante para el desempeño de QP478, y que los genes potencialmente beneficiosos deberían estar en la región PP_5050–PP_5083, que permanece intacta en LC173. Por lo tanto, a continuación buscamos identificar los genes en esta región que contribuyeron al crecimiento mejorado en xilosa.

a Identificación de la región duplicada a partir de datos de secuenciación de próxima generación, que presentaron ~2 veces el número de lecturas de secuenciación en QP478, y eliminaciones completas y parciales de estas regiones duplicadas en LC171 y LC173, respectivamente. Los gráficos de cobertura se generaron en Geneious Prime 2020.0.4. b Curvas de crecimiento de QP478, LC171 y LC173 en medio M9 con xilosa 30 mM. λ representa el retraso en el crecimiento, μA representa la tasa de crecimiento absoluta y ambos son los valores promedio de tres curvas de crecimiento independientes. c Sobreexpresión de genes candidatos en la cepa de ingeniería inversa LC100 en el sitio ΔpykF. d Curvas de crecimiento de QP478, LC100, LC199 y LC224 en medio M9 con xilosa 30 mM. e Tasas de crecimiento específicas máximas extraídas del panel d. f Valores de retardo de crecimiento extraídos del panel d. Perfiles g–i en experimentos de matraz de agitación de la cepa LC224 en medio M9 con xilosa 30 mM, glucosa 30 mM + xilosa 15 mM y glucosa 30 mM, respectivamente. Para los experimentos en matraces agitados, el % de rendimiento molar se calculó como [mM muconato/mM (glucosa + xilosa) × 100], y el % de rendimiento de carbono se calculó como [mM muconato × 6/mM (glucosa × 6 + xilosa × 5) × 100 ]. Las barras de error aquí representan la desviación estándar de tres réplicas biológicas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Dado que la glucosa y la xilosa se utilizaron a tasas igualmente bajas en LC100 (Fig. 2d), razonamos que el crecimiento lento podría manifestarse en parte (s) de la vía compartida por ambos azúcares. Se seleccionaron tres genes candidatos dentro de PP_5050–PP_5083 para la sobreexpresión en LC100, incluido uno relacionado con el metabolismo del azúcar, PP_5056 (gpmI, fosfoglicerato mutasa independiente de 2,3-bisfosfoglicerato), y dos en la ruta del shikimato, PP_5078 (aroB, 3-deshidroquinato sintasa) y PP_5079 (aroK, shikimato quinasa) (Fig. 4c). También se probaron otros dos genes fuera de esta región pero relacionados con el metabolismo del azúcar, incluidos PP_5085 (maeB, enzima málica B) y PP_5150 (rpiA, ribosa-5-fosfato isomerasa A). Luego se insertaron casetes de sobreexpresión de los cinco genes individualmente en el sitio ΔpykF, generando las cepas LC147 (gpmI), LC150 (maeB), LC151 (rpiA), LC199 (aroK) y LC224 (aroB). Todos estos genes fueron impulsados ​​por el promotor Ptac excepto gpmI, que fue impulsado por el promotor Plac después de dos intentos fallidos de insertar el gen en el genoma usando Ptac. Luego, las cepas resultantes se evaluaron con LC100 y QP478 en un lector de placas que contenía medio M9 y xilosa 30 mM (Fig. 4d-f). La sobreexpresión de los tres genes relacionados con el metabolismo del azúcar en LC100 no redujo el retraso del crecimiento, mientras que las cepas LC150 y LC151 demostraron tasas de crecimiento más altas y una mayor acumulación de biomasa final (Figura 9 complementaria). Teniendo en cuenta que un mayor rendimiento de biomasa puede reducir el rendimiento de muconato, como observamos con la cepa LC091 (Fig. 2b-d), decidimos no perseguir más estos objetivos. Las cepas LC199 y LC224, que sobreexpresan aroK y aroB, respectivamente, demostraron tasas de crecimiento mejoradas y un retraso de crecimiento reducido en comparación con LC100 (Fig. 4d-f). LC224 creció incluso más rápido que QP478 con un tiempo de retraso similar y una tasa de crecimiento más alta (Fig. 4d-f).

Para investigar el posible efecto aditivo de sobreexpresar aroK y aroB, también expresamos aroK y aroB en un patrón similar al operón como aroKB en LC100, generando la cepa LC168. Las cepas LC199, LC224, LC168 y QP478 se evaluaron en experimentos de matraces agitados con medio M9 que contenía glucosa y xilosa para examinar la producción de muconato. La cepa de sobreexpresión de aroB LC224 superó a su contraparte evolucionada QP478 con un mayor rendimiento de muconato y una tasa de crecimiento mejorada (Fig. 10a, c complementaria), lo que sugiere que la reacción de DAHP a 3-deshidroquinato (3DHQ) fue limitante de la tasa en LC100. La sobreexpresión de aroK en LC100 (generando LC199) aumentó ligeramente la tasa de crecimiento (Fig. 10b, d complementaria). La cepa LC168 no mostró una mejora en comparación con LC224 (Figura complementaria 10c, e).

Para investigar si la sobreexpresión de aroB por sí sola puede conducir a un mejor rendimiento de la cepa, sobreexpresamos aroB en QP328, generando la cepa LC349. En la evaluación del lector de placas de las cepas LC349, QP328 y LC224, LC349 exhibió la tasa de crecimiento más alta en glucosa y una tasa de crecimiento ligeramente más baja en la mezcla de glucosa y xilosa en comparación con LC224, mientras que no es sorprendente que el crecimiento en xilosa sea mucho más lento en relación con LC224 (Fig. . 11a–c), probablemente debido a la falta de mutaciones en xylE. Curiosamente, en el experimento de matraces de agitación sobre una mezcla de glucosa y xilosa, LC349 superó a QP328 con un rendimiento de muconato mucho mayor, que aún era significativamente más bajo que LC224 (Fig. 11d-f complementaria). La producción de muconato de LC349 es más lenta que la de LC224, ya que se necesitaron hasta 41 h para LC349 y 26,5 h para LC224 para alcanzar el título máximo de muconato (Figura complementaria 11e, f).

A continuación, examinamos el rendimiento de LC224 en medio M9 que contenía glucosa, xilosa o una mezcla de los dos. Los rendimientos de muconato fueron más altos en xilosa, más bajos en glucosa e intermedios en la mezcla (Fig. 4g-i), lo que refleja el beneficio de introducir xilosa en la ruta de las pentosas fosfato para suministrar E4P. Curiosamente, las tasas de utilización de glucosa y xilosa fueron más altas con la mezcla de glucosa y xilosa en comparación con glucosa o xilosa sola (Fig. 4g-i).

Los cultivos de biorreactor de LC224 y QP478 se realizaron en modo de lote alimentado para mantener las concentraciones de azúcar (glucosa y xilosa) por debajo de 10 g L-1 (Fig. 12a-c complementaria). La glucosa y la xilosa se utilizaron simultáneamente en ambas cepas desde el inicio del cultivo (Fig. 5a, b); sin embargo, las tasas de utilización de azúcar fueron más altas en LC224 que en QP478. LC224 utilizó 46 g L-1 de glucosa y 20 g L-1 de xilosa al final del cultivo, mientras que QP478 utilizó 34 g L-1 y 10 g L-1, respectivamente. El título de muconato fue casi tres veces mayor en LC224 en comparación con QP478, 26,8 g L-1 y 9,3 g L-1, respectivamente (Fig. 5a, b). Los rendimientos de muconato alcanzaron el 50 % (rendimiento molar) en LC224, mientras que los rendimientos fueron del 25,9 % en QP478 (Fig. 5a, b). Estas mejoras en LC224 también se reflejaron en la tasa general de producción de muconato (0,28 g L-1 h-1), que fue sustancialmente más alta que la lograda en QP478 (0,10 g L-1 h-1) (Fig. 5a, b) .

a, b Crecimiento bacteriano, utilización de glucosa y xilosa y títulos, rendimientos y tasas de muconato de QP478 y LC224 en cultivos de 96,6 h. c Crecimiento bacteriano, utilización de glucosa y xilosa, y título, rendimiento y tasa de muconato de LC224 en un cultivo de 191 h. Para a y b, los puntos de datos representan los valores promedio de los duplicados biológicos, las barras de error representan la diferencia absoluta entre los datos generados a partir de los duplicados en cada punto de tiempo; para (c), los puntos de datos representan los valores de los singletes. Los rendimientos metabólicos (% en moles) en cada punto de tiempo se calcularon como la cantidad de muconato (en moles) producida dividida por la glucosa y la xilosa (en moles) utilizadas. Los rendimientos metabólicos (% en moles) se corrigen en función del factor de dilución generado por los volúmenes de alimentación de base y sustrato. Los rendimientos finales de carbono (% de carbono) enumerados se calcularon como [muconato mM × 6/mM (glucosa × 6 + xilosa × 5) × 100]. Las tasas (g L-1 h-1) en cada punto de tiempo se calcularon como la concentración de muconato dividida por el tiempo de cultivo. Todos los valores de título (T), tasa (R) y rendimiento (Y) enumerados estaban en el último punto de tiempo. Los rendimientos finales (% en moles, % de carbono) enumerados en (c) también se han corregido en función del volumen evaporado cuantificado. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El título, la tasa y el rendimiento de muconato logrados en los cultivos del biorreactor fueron 26,8 g L-1, 0,28 g L-1 h-1 y 49,9 % (Fig. 5b), respectivamente, a las 96,6 h. Este rendimiento representa casi el 100% del máximo teórico basado en nuestro diseño de cepas y modelado metabólico (vida supra). Para explorar si el título podría mejorarse aún más, realizamos otro experimento de biorreactor en el que se cultivó LC224 durante 191 h (Fig. 5c). El título de muconato resultante aumentó a 33,7 g L−1 y con un rendimiento del 46 %, 92 % del máximo teórico cuando se corrige por evaporación. También es digno de mención que mientras LC224 alcanzó la fase estacionaria a las ~54 h, las células continuaron utilizando azúcares y produciendo muconato, lo que demostró que la producción de muconato aquí no estaba acoplada al crecimiento, lo que sugiere que el título y el rendimiento de muconato podrían mejorarse aún más si el experimento había continuado (Fig. 5b, c).

Para comprender mejor las diferencias entre el padre no evolucionado QP328, la cepa evolucionada QP478 y la cepa LC224 diseñada racionalmente, se realizaron experimentos de metabolómica intracelular y extracelular. Los metabolitos seleccionados relacionados con el metabolismo del azúcar y la producción de muconato se presentan en la Fig. 6. En comparación con QP328, las cepas QP478 y LC224 exhibieron una acumulación reducida de metabolitos en el ciclo EDEMP y una mayor acumulación de metabolitos en las vías del shikimato y el muconato (Fig. 6a, b), lo cual es consistente con las mutaciones que evolucionaron en QP478 y fueron diseñadas en LC224 (Figs. 2 y 4). Sin embargo, las intensidades de DAHP, el nodo conjunto del metabolismo del azúcar y la vía del shikimato, demostraron el patrón opuesto en comparación con otros metabolitos en la vía del shikimato (Fig. 6b). LC224 y QP478 acumularon menos DAHP en comparación con QP328, lo que es consistente con nuestro objetivo anterior con respecto a la duplicación y la sobreexpresión de aroB.

una vía metabólica simplificada. Los metabolitos en el ciclo EDEMP están etiquetados en azul, en la ruta del shikimato y el muconato están etiquetados en verde, el nódulo articular DAHP está etiquetado en púrpura, el ácido antranílico extracelular (ANA) está etiquetado en marrón. Ácido quínico QA, ácido antranílico ANA. b Intensidad de metabolitos seleccionados en las tres cepas QP328 (azul), QP478 (naranja) y LC224 (rojo). Las intensidades intracelulares se han normalizado mediante biomasa liofilizada. Las barras de error representan la desviación estándar de tres réplicas biológicas. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Específicamente, el nivel de DAHP en LC224 fue mucho más bajo en comparación con QP478, lo que puede sugerir que la actividad de aroB en LC224 impulsada por el promotor tac fue mayor que la de QP478. Excepto por DAHP, LC224 acumuló una mayor cantidad de metabolitos en la vía del shikimato y menos metabolitos en el ciclo EDEMP en relación con QP478 (Fig. 6a, b), lo que sugiere un mayor flujo que ingresa a la vía del shikimato en LC224 y permite una mayor biosíntesis de muconato.

Aunque su precursor 3DHQ no se detectó en ninguna muestra, el ácido quínico (quinato, QA) se acumuló sustancialmente en LC224 (Fig. 6b), lo que puede sugerir un desbordamiento de carbono como resultado de la sobreexpresión de aroB. La acumulación de ácido shikímico (shikimato, SA) en LC224 es evidencia de biosíntesis de muconato a través de la vía aroE, mientras que la acumulación de SA fue mucho menor en QP478 en relación con LC224, lo que puede estar relacionado con la duplicación de aroK en QP478. La acumulación de ácido antranílico en los medios de cultivo probablemente representa otro caso de metabolismo de desbordamiento. Se acumuló más catecol (CAT) en LC224 (Fig. 6b), lo que podría representar nuevos cuellos de botella asociados con un mayor flujo al muconato. Juntos, estos resultados ilustran que la ingeniería para generar LC224 recapituló ampliamente la cepa evolucionada QP478 y sugiere objetivos adicionales para una mayor mejora.

Se necesitan tecnologías para la producción de bioquímicos sustentables para desplazar a los petroquímicos establecidos. Para este esfuerzo es fundamental la ingeniería de cepas para convertir los azúcares lignocelulósicos, como la glucosa y la xilosa, en productos con títulos, tasas y rendimientos industrialmente relevantes. En este trabajo, el rendimiento molar teórico máximo de muconato a partir de una mezcla de glucosa y xilosa aumentó de ~40 % con glucosa sola a 50 % cuando el contenido de xilosa en la mezcla está entre 33 y 40 % (mol%), que es un proporción relevante en hidrolizados lignocelulósicos (Fig. 1b, Fig. 1 complementaria). Esto se logró introduciendo la vía de la d-xilosa isomerasa para suministrar E4P y reintroduciendo pgi-1 para habilitar el ciclo EDEMP. ALE se utilizó para identificar objetivos adicionales para diseñar una cepa que finalmente logró un rendimiento del 46 % en una mezcla de glucosa y xilosa (Fig. 5c), considerablemente más alto que el 35,6 % que habíamos logrado previamente con una cepa diseñada para convertir glucosa sola32.

Durante ALE, surgieron mutaciones en xylE en todos los aislados seleccionados (Figs. 2a y 3f) que mejoraron el crecimiento en xilosa. Las cinco mutaciones están en los dominios transmembrana del transportador (Fig. 3f). Con base en trabajos previos en el mismo sistema35 y nuestros propios datos que muestran que el metabolismo de la xilosa se inhibió en la cepa QP328 productora de muconato (Figs. 1c y 2b) pero no en el análogo LC345 que no produce muconato (Fig. 2a complementaria), proponemos que las mutaciones fueron una respuesta a los inhibidores de la cepa de fondo productora de muconato. En trabajos futuros se realizarán más investigaciones para identificar y caracterizar los posibles inhibidores. Además, el aumento de la expresión de PP_2569, un supuesto transportador MFS, habilitado por una mutación puntual G→A en la región promotora, condujo a un rendimiento de muconato sustancialmente mayor y un rendimiento de biomasa más bajo en LC100 (Fig. 2b, c), y el análisis metabolómico sugirió un el flujo metabólico se redirige desde el ciclo EDEMP a la vía del shikimato (Fig. 3a). El análisis de metabolómica intracelular y extracelular de las cepas LC091 y LC100 cultivadas en xilosa sugirió que PP_2569 puede exportar ácido antranílico, lo que reduce la acumulación intracelular de aminoácidos aromáticos, que se sabe que inhiben las DAHP sintasas nativas. También observamos intensidades más altas de ácido antranílico extracelular en las cepas QP478 y LC224 en comparación con la cepa QP328 no evolucionada (Fig. 6b). Los estudios mecanicistas con PP_2569 pueden ser de utilidad para una mayor ingeniería.

ALE también resultó en una duplicación de la región genómica de PP_5050–PP_5242. Dentro de esta región, demostramos que la sobreexpresión de aroB era necesaria para alcanzar altas tasas de crecimiento en xilosa en LC224. En la cepa GB062, una cepa diseñada previamente para mejorar la conversión de glucosa en muconato mediante la eliminación de hexR en CJ5223, la transcriptómica indicó que la expresión de aroB ya aumentó con la eliminación de hexR32. En otro estudio en el que se diseñó P. putida para producir PCA a partir de glucosa, la sobreexpresión de aroB no contribuyó a mejorar la producción45. Sin embargo, en la cepa LC100 cultivada en una mezcla de glucosa y xilosa, la actividad de AroB parecía limitar la velocidad, ya que la sobreexpresión de aroB en LC224 mejoró el crecimiento y la producción de muconato (Fig. 4d-i y Fig. 10b, c complementarias). Esto puede indicar que con la entrada de la xilosa en la ruta de las pentosas no oxidantes, se mejoró el suministro de E4P, lo que llevó a un mayor flujo de carbono en la ruta del shikimato a través de la condensación de E4P y PEP a DAHP. El nivel mejorado de DAHP hizo que la siguiente reacción, catalizada por AroB, limite la velocidad, donde no estaba antes. En general, la estrategia de ingeniería que se muestra aquí para mejorar el flujo de carbono hacia y a través de la vía del shikimato podría aprovecharse para mejorar la producción de otros productos derivados del shikimato a partir de glucosa y xilosa en P. putida.

Nuestra cepa LC224 diseñada racionalmente superó a la cepa evolucionada QP478 en crecimiento en xilosa (Fig. 4d). Una posible razón podría ser la redundancia, la complejidad y la carga de la gran duplicación en QP478. Es probable que tales duplicaciones estén habilitadas por la recombinación dentro de secuencias similares en dos o más ubicaciones dentro del genoma, de modo que la duplicación de ciertas regiones se ve favorecida o limitada, lo que en última instancia limita la capacidad de la evolución para llegar a resultados ideales dentro de escalas de tiempo de laboratorio. La ingeniería del genoma, sin embargo, se puede utilizar para realizar cambios precisos. De hecho, la sobreexpresión de aroB solo en LC224 superó a QP478 (Fig. 4d-f y Fig. 10a, c complementaria), que contiene la duplicación completa de PP_5050-PP_5242. Esto demuestra la utilidad y el poder de ALE como herramienta para identificar objetivos para la ingeniería racional.

La sobreexpresión de aroB mejoró sustancialmente la utilización de azúcar de LC224 en relación con LC100 (Figs. 2d y 4h). En el análisis de metabolómica, el nivel de DAHP intracelular de LC224 es más bajo que el de las otras dos cepas (Fig. 6). Esto puede sugerir que la acumulación de DAHP tiene un efecto negativo en el metabolismo del azúcar que puede aliviarse mediante la sobreexpresión de aroB. Además, la sobreexpresión de aroB sola en QP328, generando LC349, condujo a un rendimiento de muconato ligeramente más bajo en comparación con LC224 en una mezcla de glucosa y xilosa (Fig. 11d-f complementaria). Dado que restaurar la mutación G→A en PPP_2569 en la cepa QP478 no tuvo un efecto comparable a la ingeniería inversa en LC091 en términos de variación del rendimiento de muconato (Fig. 2c y Fig. 6g, h complementaria), estos resultados juntos pueden sugerir que aroB la sobreexpresión (como resultado de la duplicación) y la regulación positiva de PP_2569 tienen un efecto similar en la reducción de la inhibición de la retroalimentación de las DAHP sintasas, lo que condujo a un flujo mejorado en la vía biosintética del muconato.

El análisis metabolómico de nuestras cepas diseñadas brinda información preliminar sobre los futuros esfuerzos de ingeniería para mejorar aún más la producción de muconato, más allá de lo que demostramos aquí con LC224, que se seguirá en estudios futuros. La acumulación de quinato por esta cepa (Fig. 6b) puede sugerir un enfoque para mejorar su rendimiento mediante la sobreexpresión de aroQ o la eliminación de quiA. En cuanto a la acumulación de shikimato, la sobreexpresión de aroB y aroK no mejoró el rendimiento de LC168 en relación con LC224, la cepa equivalente que sobreexpresa aroB solo (Fig. 4h y Fig. 10c, e complementarias). Esto puede sugerir cuellos de botella potenciales en los pasos posteriores de la vía, especialmente considerando el nivel relativamente alto de ácido antranílico extracelular (ANA) acumulado por QP478 (Fig. 6b). La conversión insuficiente de corismato (CSA) a 4-hidroxibenzoato (4HB) podría ser una de las causas de la acumulación de ácido antranílico. El gen ubiC-C22 que codifica el corismato piruvato-liasa, que se diseñó previamente para reducir la inhibición del producto, fue impulsado en nuestras cepas por el promotor lac relativamente débil, y un enfoque potencial para acelerar la biosíntesis de muconato a través de shikimato en LC224 podría ser sobreexpresar aroK mientras aumentando simultáneamente el nivel de expresión de ubiC-C22.

El análisis tecnoeconómico realizado anteriormente para la conversión de glucosa, así como azúcares de glucosa y pentosa3 indicó que el precio mínimo de venta (MSP) del muconato disminuiría sustancialmente con un mayor rendimiento y tasa. Nuestra cepa diseñada GB271 produjo muconato a partir de glucosa con un rendimiento del 36 % y una tasa de 0,21 g L−1 h−1, lo que corresponde a una MSP de alrededor de $3 kg−1 según este modelo32. Aquí, LC224 logró un rendimiento de casi el 50 % con 0,28 g L−1 h−1 (Fig. 5b). Esto reduciría el MSP a alrededor de $2,2 kg−1, que está cerca del MSP de $1,96 que se había pronosticado previamente como comercialmente viable3. El modelo sugiere que el MSP se puede reducir aún más aumentando la tasa y el rendimiento. Teniendo en cuenta que el rendimiento molar del 50 % ya está en el máximo teórico en nuestro diseño de cepa, los aumentos adicionales de la tasa serán clave para las mejoras de MSP.

En conclusión, este trabajo demuestra una estrategia efectiva para producir muconato a partir de glucosa y xilosa usando P. putida. Teniendo en cuenta el rendimiento prometedor y el título de muconato de glucosa y xilosa, nuestra cepa LC224 también podría representar una cepa de plataforma prometedora para la producción de otros compuestos derivados de la vía del shikimato.

Se usó Q5® High-Fidelity 2X Master Mix (New England Biolabs) para todas las reacciones en cadena de la polimerasa, seguida de digestión con DpnI (New England Biolabs) para eliminar la plantilla de plásmido derivada de células cuando fue necesario. NEBuilder HiFi Assembly Master Mix (New England Biolabs) se utilizó para la construcción de plásmidos, seguido de la transformación en NEB 5-α F'Iq E. coli químicamente competente (New England Biolabs), o en CopyCutter™ EPI400™ electrocompetente E. coli para aumentar rendimiento de plásmido, todo de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Los transformantes se seleccionaron en placas de agar Lysogeny Broth (LB) (Lennox) complementadas con 50 μg mL-1 de kanamicina (Sigma-Aldrich) y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Las construcciones correctas se confirmaron mediante secuenciación de Sanger (GENEWIZ, Inc.). Se sintetizaron algunos plásmidos (Twist Bioscience). La información detallada sobre la construcción de plásmidos se describe en Datos complementarios 2. Las secuencias para los plásmidos sintetizados se encuentran en Datos complementarios 3. Los oligos utilizados en la construcción de plásmidos se enumeran en Datos complementarios 4.

Se realizaron deleciones, inserciones y reemplazos de genes utilizando el gen nptII resistente a la kanamicina como marcador de selección para la primera ronda de recombinación homóloga del plásmido en el cromosoma y el gen sacB sensible a la sacarosa como marcador de contraselección para la segunda ronda de homóloga. recombinación fuera del cromosoma52. Las deleciones, inserciones y reemplazos de genes correctos se identificaron mediante el producto de PCR de colonias de diagnóstico en función de las diferencias en el tamaño o la presencia del producto utilizando MyTaqTM Red Mix (Bioline). Para las inserciones y restauraciones de mutaciones puntuales, se examinaron los reemplazos correctos comparando la intensidad de las bandas de los productos de PCR de colonias utilizando cebadores en los que el nucleótido 3' se hibridaba con el nucleótido mutado, seguido de confirmación con secuenciación de Sanger.

Los plásmidos se transformaron en P. putida mediante electroporación o conjugación. Para la electroporación, se inocularon cepas de P. putida a partir de un stock de glicerol en medio LB y se cultivaron durante la noche a 30 °C, 225 rpm. Las células electrocompetentes se prepararon centrifugando 2,5 ml de cultivo durante la noche y lavando tres veces con sacarosa 300 mM, seguido de la resuspensión de las células en 50 µl de sacarosa 300 mM53. Los plásmidos para la electroporación se construyeron utilizando el plásmido principal pK18sB54 y se sometieron a electroporación en una cubeta de 0,1 cm utilizando un Gene Pulser Xcell (Bio-Rad) con el ajuste de 1,6 kV, 25 μF, 200 ohmios. Todo el proceso se realizó a temperatura ambiente. Para la conjugación, los plásmidos se construyeron sobre la base del plásmido pK18msB de la columna vertebral que contiene el R4P oriT, y se transfirieron de las células55 de E. coli S17-1 del donante a las cepas de P. putida del receptor. La cepa donante de E. coli S17-1 que contenía el plásmido se inoculó en medio LB suplementado con 50 μg mL−1 de kanamicina y se cultivó en una incubadora con agitación a 37 °C, 225 rpm durante la noche; la cepa receptora de P. putida se inoculó en medio LB y se cultivó en una incubadora con agitación durante la noche a 30 °C, 225 rpm. Posteriormente, se centrifugaron 1 ml de células receptoras y donantes durante la noche a 5000 × g durante 2 min y se lavaron dos veces con medio LB, luego se resuspendieron los sedimentos y se mezclaron 400 µl de cada uno en un tubo de microcentrífuga y se centrifugaron nuevamente. Los sedimentos mixtos se resuspendieron usando 50 µL de medio LB y se colocaron en una placa LB con dos antibióticos a baja concentración: 10 µg mL−1 de cloranfenicol para inhibir el crecimiento celular de E. coli S17-1 y 5 µg mL−1 de kanamicina para inhibir crecimiento celular de P. putida. La placa se incubó a 30 °C durante 6 a 10 h para permitir la conjugación, después de lo cual las células se sembraron en estrías para obtener colonias individuales en la misma placa y se incubaron a 30 °C durante la noche. Las colonias individuales en la placa LB que contenían antibióticos de baja concentración se volvieron a colocar en una nueva placa LB con 100 μg mL-1 de cloranfenicol, al que P. putida es naturalmente resistente, y 50 μg mL-1 de kanamicina, para seleccionar transconjugantes. Todas las cepas utilizadas en este estudio se describen en la Tabla 1, la información detallada sobre la construcción de cepas se describe en Datos complementarios 5.

For shake flask and growth curve experiments, seed cultures were inoculated from glycerol stocks into 14-mL round bottom Falcon® tubes containing 5 mL of LB Miller medium and incubated overnight at 30 °C and 225 rpm. Overnight cultures were then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 10 mL LB medium to an initial OD600 of 0.2. These second seed cultures were cultivated at 30 °C at 225 rpm for 4 h to reach an OD600 of ~2. The second seed cultures were washed twice with M9 salts (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl) and then inoculated into a 125-mL baffled shake flask containing 25 mL modified M9 minimal medium (6.78 g L−1 Na2HPO4, 3 g L−1 KH2PO4, 0.5 g L−1 NaCl, 1 g L−1 NH4Cl, 2 mM MgSO4, 100 µM CaCl2, 18 µM FeSO4) supplemented with either 30 mM xylose, 30 mM glucose, or mixture of 30 mM glucose and 15 mM xylose, to an initial OD600 of 0.1. The molar ratio of glucose and xylose in mixed substrates is 2:1, which is the ratio typical of corn stover hydrolysates10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3149"> 56. Todas las curvas de crecimiento se caracterizaron en analizadores Bioscreen C Pro (Growth Curves US) usando cultivos de 300 µL inoculados como se describe para los matraces de agitación anteriores. Los datos de los matraces de agitación y del lector de placas se trazaron y analizaron utilizando GraphPad Prism versión 8.4.2. La tasa de crecimiento absoluta (μA) y el retraso de crecimiento (λ) se calcularon en función de la ecuación de Gompertz utilizando la configuración predeterminada de la herramienta FittR depositada en GitHub (https://github.com/scott-saunders/growth_curve_fitting)57. En algunos casos, la fase de muerte se eliminó de la curva de crecimiento para ajustar el modelo.

Los valores de pH de los matraces se monitorearon en cada punto de tiempo de muestreo usando un medidor de pH mini (HORIBA LAQUAtwin pH-33), y cuando fue necesario, se usó NaOH 1 N para ajustar el pH a 7. Para los experimentos de matraces agitados, se calcularon los rendimientos en el momento en que se detectó la concentración máxima de muconato.

Un modelo metabólico de carbono central de P. putida3, que considera la reacción que se muestra en la Fig. 1a, se amplió con reacciones de la ruta sintética aroE, utilizando la estequiometría adaptada de un modelo a escala del genoma de P. putida KT244058. Los cálculos de rendimiento se realizaron asumiendo que no hay necesidad de mantenimiento de ATP mediante la optimización del flujo de muconato mientras se variaba la fracción de xilosa en el medio. Los cálculos se realizaron utilizando la biblioteca cobrapy (versión 0.22.1) en Python 3.8.1059.

Para realizar ALE, primero se inoculó la cepa QP328 en medio LB Miller a partir de un stock de glicerol y se cultivó durante la noche como un cultivo de semillas. A continuación, las células del cultivo de toda la noche se lavaron dos veces con sales M9 y se resuspendieron en sales M9. Las células lavadas se inocularon a una DO600 inicial de 0,1 en un tubo de cultivo que contenía 5 ml de medio M9 con xilosa 10 mM como única fuente de carbono y se cultivaron a 30 °C con agitación a 225 rpm. Se realizaron pases en serie transfiriendo el 1 % (v/v) del cultivo a medio fresco cuando se observó crecimiento, lo que inicialmente tomó alrededor de dos semanas de cultivo. El número de generaciones se calculó con base en el valor de OD600, según la Ec. (1):32

Las poblaciones iniciales, intermedias periódicas y finales se conservaron como reservas de glicerol.

Los isómeros de ácido mucónico cis, cis y cis, trans se analizaron mediante la preparación de un estándar único de ácido mucónico cis, trans para lograr una cuantificación precisa de ambos isómeros de ácido mucónico60. La separación y detección se lograron usando las siguientes condiciones cromatográficas. Las muestras y los estándares se analizaron utilizando un UHPLC Agilent serie 1290 (Agilent Technologies) acoplado con un detector de matriz de diodos (DAD) y una columna Phenomenex Luna C18(2)-HST de 2,5 μm, columna de 2 × 100 mm. Se inyectó un volumen de inyección de 1 μL en la columna en la que la temperatura se mantuvo constante a 45 °C. Los isómeros de ácido mucónico se monitorearon y cuantificaron a la longitud de onda de 265 nm con un rango de cuantificación de 1 ppm a 500 ppm. Se utilizó un gradiente de ácido fórmico al 0,16 % en agua (A) y acetonitrilo (B) a un caudal de 0,5 ml min−1. La separación cromatográfica de los analitos se logró usando el siguiente programa de gradiente: inicial (t0) a t = 1 min: A-100 % y B-0 %; rampa a A-50% y B-50% desde t = 1–7.67 min; rampa a A-30% y B-70% desde t = 7,67–9,33 min y se mantiene hasta 10,67 min. A los 10,68 min, el gradiente volvió a A-100 % y B-0 % y se mantuvo isocrático durante un tiempo total de ejecución de 13 min. Se ejecutó un estándar de verificación de calibración cada 10 a 15 muestras para garantizar la estabilidad del detector. La glucosa se cuantificó por HPLC con detección del índice de refracción acoplada con una columna Aminex HPX-87H (Bio-Rad)61, mientras que la xilosa se cuantificó de manera similar y simultánea. Los estándares puros se adquirieron de Sigma-Aldrich.

Para la PCR de transcripción inversa cuantitativa (RT-qPCR) de PP_2569 en las cepas LC091 y LC100, las células se cultivaron en matraces de agitación con M9 y xilosa 30 mM de acuerdo con el protocolo de matraces de agitación mencionado anteriormente. Para la RT-qPCR de PP_4302 en las cepas LC100 y LC224, las células se cultivaron en matraces de agitación con medio LB. Las células se recolectaron en la fase logarítmica media y se rompieron con el reactivo TRI® (Sigma, T9424), seguido de una minipreparación de ARN con el kit de minipreparación de ARN Direct-zolTM (Zymo Research, R2052) siguiendo el protocolo. Luego, los ARN totales extraídos se digirieron con ADNasa I (Zymo Research, E1009-A) y se purificaron con el kit RNA Clean & ConcentratorTM-5 (Zymo Research, R1014). Las concentraciones de ARN se determinaron usando NanoDropTM one (Thermo Scientific) a 260 nm, se agregaron 500 ng de ARN total de cada muestra para la transcripción inversa, usando iScript™ Reverse Transcription Supermix (Bio-Rad), para sintetizar ADNc. La RT-qPCR se realizó con KiCqStart® SYBR® Green qPCR ReadyMix (Sigma-Aldrich), con el sistema 7500 Fast Real-Time PCR (Applied Biosystems).

El gen de limpieza rpoD se empleó como control de referencia para normalizar diferentes muestras62. Se usaron los cebadores oLC-0109 y oLC-0110 para amplificar rpoD; oLC-0107 y oLC-0108 se utilizaron para amplificar PP_2569; oLC-0353 y oLC-0354 se utilizaron para amplificar PP_4302. Usamos el método 2-ΔΔCt para cuantificar los niveles transcripcionales entre muestras63.

Para evaluar las cepas QP478 y LC224 en biorreactores, las cepas se inocularon a partir de stocks de glicerol en matraces con deflectores de 250 mL que contenían 50 mL de LB (Miller) y se incubaron a 30 °C y 225 rpm durante 16 h. Los cultivos de semillas se realizaron por duplicado para cada cepa y cada réplica se utilizó para inocular biorreactores independientes. Las células se centrifugaron (5000 xg, 10 min), se descartó el sobrenadante y las células se resuspendieron en 5 ml de M9 modificado. El M9 modificado contenía 13,56 g L-1 Na2HPO4, 6 g L-1 KH2PO4, 1 g L-1 NaCl, 2 g L-1 (NH4)2SO4, 2 mM MgSO4, 100 μM CaCl2 y 36 μM FeSO4.

Cells were inoculated in 0.5 L bioreactors (BioStat-Q Plus, Sartorius Stedim Biotech) at an initial OD600 of 0.2. The batch phase consisted of growth on 300 mL of modified M9 with 10.6 g L−1 glucose and 4.4 g L−1 xylose, which mimics the sugar ratio in sugar hydrolysates from corn stover10% v/v) during fermentation without hydrolysate purification or concentration. Energy Environ. Sci. 9, 1237–1245 (2016)." href="/articles/s41467-022-32296-y#ref-CR56" id="ref-link-section-d4408857e3452"> 56. La fase de alimentación por lotes se inició cuando la concentración de azúcar era de aproximadamente 7 g L-1, momento en el que se alimentaron los azúcares para mantener las concentraciones de azúcar entre ~2 y 10 g L-1 modificando manualmente las tasas de alimentación. La solución de alimentación contenía 353 g L-1 de glucosa y 147 g L-1 de xilosa, y su pH se ajustó a pH 7 con NaOH. Los biorreactores se controlaron a pH 7 mediante la adición de NH4OH 4 N, a 30 °C, y se roció aire a 1 vvm. La velocidad de agitación inicial en la fase discontinua fue de 350 rpm. Cuando el oxígeno disuelto (OD) alcanzó un valor del 30%, se controló automáticamente a ese nivel mediante ajustes automáticos de agitación. Se tomaron muestras periódicamente para evaluar el crecimiento bacteriano y analizar las concentraciones de azúcar y muconato.

Los sedimentos celulares y las muestras de sobrenadante se recolectaron por separado mediante centrifugación de 1 ml de cultivos en matraz agitado cultivados en una mezcla de glucosa y xilosa en la fase logarítmica media (DO600 ~ 1,0), y las muestras se congelaron a -80 °C hasta el análisis. . Los sedimentos celulares se liofilizaron y los metabolitos intracelulares se extrajeron de 3 mg de biomasa seca utilizando una mezcla de disolventes de cloroformo/metanol/agua64, y las capas orgánica y acuosa se transfirieron a un vial nuevo y se secaron por completo. Los metabolitos extracelulares se prepararon secando las muestras sobrenadantes al vacío antes del análisis. Los metabolitos se derivatizaron químicamente según el método siguiente65. Para proteger los grupos carbonilo y disminuir la formación de isómeros tautoméricos, a cada extracto seco se le añadió una solución de metoxiamina (20 µL de un stock de 30 mg mL−1 en piridina). A continuación, las muestras se incubaron a 37 °C con agitación durante 90 min. Para eliminar los protones ácidos en los grupos hidroxilo, amino y carboxilo, se utilizó una reacción de trimetilsililación, específicamente se añadió a cada vial N-metil-N-(trimetilsilil) trifluoroacetamida con trimetilclorosilano al 1 % (80 µl). Las muestras se incubaron nuevamente a 37 °C con agitación continua durante 30 min. Una vez completada la incubación, los viales se centrifugaron y el líquido se transfirió a un inserto de vidrio de pequeño volumen. Las muestras se analizaron mediante cromatografía de gases-espectrómetro de masas (GC-MS) utilizando una columna HP-5MS (30 m × 0,25 mm × 0,25 µm; Agilent Technologies) para análisis no dirigidos. Se inyectó un volumen de 1 µl de cada muestra en modo splitless y se estableció el caudal de gas helio mediante la función de bloqueo del tiempo de retención basada en el tiempo de elución del ácido mirístico deuterado (Agilent Technologies, Santa Clara, CA). La temperatura del puerto de inyección se mantuvo a 250 °C durante todo el análisis. El gradiente del horno de GC comenzó con una temperatura de 60 °C mantenida durante 1 min después de la inyección, seguida de un aumento a 325 °C a una velocidad de 10 °C min−1, y finalizó con una retención de 10 min a 325 °C. La recopilación de datos de MS cubrió el rango de masas de 50 a 600 m/z. Se analizó una mezcla de ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME, C8-C28) junto con cada lote de muestras para poder realizar la alineación del índice de retención en el análisis de datos posterior. Los archivos de datos de GC-MS se convirtieron a formato CDF y se desconvolucionaron y alinearon utilizando el software Metabolite Detector 2.566. La identificación de los metabolitos se realizó mediante la comparación con las bases de datos de metabolómica del PNNL, versión aumentada de la base de datos de Fiehn67. Esta base de datos contiene información sobre espectros de masas e índices de retención de más de 1000 estándares químicos auténticos y ha sido cotejada con bases de datos comerciales de GC-MS, como la biblioteca espectral NIST20 y las bases de datos de GC-MS de la versión 11 de Wiley68,69. Se seleccionaron y usaron tres iones de fragmentos únicos para integrar los valores de área de pico, y algunos metabolitos se curaron manualmente cuando fue necesario.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de Nature vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación del genoma completo que respaldan los hallazgos de este estudio se han depositado en la base de datos NCBI SRA con el número de acceso PRJNA783062. Se puede acceder a PP_2569 en la base de datos de Uniprot mediante el enlace https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q88JS8/entry. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

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Este trabajo fue escrito en parte por Alliance for Sustainable Energy, LLC, el administrador y operador del Laboratorio Nacional de Energía Renovable para el Departamento de Energía de EE. UU. (DOE) bajo el Contrato No. DE-AC36-08GO28308. Este trabajo también fue escrito parcialmente por Oak Ridge National Laboratory, que es administrado por UT-Battelle, LLC, para el DOE de EE. UU. bajo el contrato DE-AC05-00OR22725. Una parte de esta investigación se realizó en el Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico (PNNL) utilizando EMSL (grid.436923.9), una instalación para usuarios de la Oficina de Ciencias del DOE patrocinada por la Oficina de Investigación Biológica y Ambiental. El PNNL es un laboratorio nacional multiprograma operado por Battelle para el Departamento de Energía (DOE) bajo el Contrato DE-AC05-76RLO 1830. El financiamiento fue proporcionado por la Oficina de Eficiencia Energética y Tecnologías de Bioenergía de Energía Renovable (BETO) del Departamento de Energía de EE. Biofundición ágil. Agradecemos a Stefan Haugen, William Michener, Morgan Ingraham y Kelley Hestmark por sus esfuerzos en análisis. Agradecemos a Scott Saunders de la Universidad de Texas Southwestern Medical Center por la herramienta de ajuste de la curva de crecimiento FittR. Agradecemos a Eugene Kuatsjah por su ayuda con Pymol. Agradecemos a Taraka Dale del Laboratorio Nacional de Los Álamos por una lectura crítica del manuscrito. Agradecemos a Jay Fitzgerald y Gayle Bentley del DOE, al profesor Eiji Masai de la Universidad Tecnológica de Nagaoka, a Kevin McNaught y a los miembros de Agile BioFoundry por sus útiles debates.

Centro de recursos renovables y ciencias habilitadoras, Laboratorio Nacional de Energía Renovable, Golden, CO, 80401, EE. UU.

Chen Ling, Davinia Salvachúa, Colin M. Kneucker, Christopher H. Calvey, Michela A. Monninger, Kelsey J. Ramirez, Peter C. St. John, Sean P. Woodworth, Christopher W. Johnson y Gregg T. Beckham

Agile BioFoundry, Emeryville, CA, 94608, EE. UU.

Chen Ling, George L. Peabody, Davinia Salvachua, Young-Mo Kim, Colin M. Kneucker, Michela A. Monninger, Nathalie Munoz Munoz, Brenton C. Poirier, Kelsey J. Ramirez, Peter C. St. John, Sean P. Woodworth, Jon K. Magnuson, Kristin E. Burnum-Johnson, Adam M. Guss, Christopher W. Johnson y Gregg T. Beckham

División de Biociencias, Laboratorio Nacional de Oak Ridge, Oak Ridge, TN, 37831, EE. UU.

George L. Peabody y Adam M. Guss

Laboratorio Nacional del Noroeste del Pacífico, Richland, WA, 99352, EE. UU.

Young-Mo Kim, Nathalie Muñoz Muñoz, Brenton C. Poirier, Jon K. Magnuson y Kristin E. Burnum-Johnson

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CL, GLP, AMG, CWJ y GTB desarrollaron el concepto del proyecto. Experimentos diseñados por CL, GLP, DS, AMG, CWJ y GTB. CL, GLP y CHC realizaron la construcción de plásmidos de ADN y la construcción de cepas de P. putida. CL, GLP y MAM realizaron experimentos con lectores de placas y matraces de agitación. CMK realizó cultivos en biorreactores. Y.-MK, NMM, BCP, JKM y KEB-J. generó los datos de metabolómica. PSJ realizó el modelado metabólico. KJR y SPW realizaron la cuantificación de analitos. CL, GLP, DS, CMK e Y.-MK realizaron análisis de datos. CL, DS, AMG, CWJ y GTB escribieron el manuscrito.

Correspondencia a Adam M. Guss, Christopher W. Johnson o Gregg T. Beckham.

CL, GTB, CWJ, AMG, GLP y DS son inventores de una patente provisional de EE. UU. (Solicitud n.° 63/321332) relacionada con la producción de ácido mucónico a partir de azúcares lignocelulósicos. Los autores restantes declaran no tener intereses contrapuestos.

Nature Communications agradece a Tsutomu Tanaka y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso abierto Este artículo tiene una licencia internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, el intercambio, la adaptación, la distribución y la reproducción en cualquier medio o formato, siempre que se otorgue el crédito correspondiente al autor o autores originales y a la fuente. proporcionar un enlace a la licencia Creative Commons e indicar si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la regulación legal o excede el uso permitido, deberá obtener el permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Ling, C., Peabody, GL, Salvachúa, D. et al. Producción de ácido mucónico a partir de glucosa y xilosa en Pseudomonas putida a través de la evolución y la ingeniería metabólica. Nat Comun 13, 4925 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

Descargar cita

Recibido: 10 noviembre 2021

Aceptado: 25 julio 2022

Publicado: 22 agosto 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-32296-y

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