Una nueva estrategia para caracterizar el patrón de β - Serie Co., Ltd del sulfato de Harbin

Scientific Reports volumen 13, Número de artículo: 9177 (2023) Citar este artículo

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El Acinetobacter baumannii (CRAb) resistente a los carbapenémicos es una amenaza urgente para la salud pública, según los CDC. Este patógeno tiene pocas opciones de tratamiento y causa infecciones nosocomiales graves con una tasa de mortalidad > 50%. Aunque estudios previos han examinado el proteoma de CRAb, no se han realizado análisis centrados en los cambios dinámicos en la expresión de β-lactamasa que pueden ocurrir debido a la exposición al fármaco. Aquí, presentamos nuestro estudio proteómico inicial de la variación en la expresión de β-lactamasa que ocurre en CRAb con diferentes antibióticos β-lactámicos. Brevemente, se indujo resistencia al fármaco a Ab (ATCC 19606) mediante la administración de varias clases de antibióticos β-lactámicos, y el sobrenadante libre de células se aisló, concentró, separó mediante SDS-PAGE, digirió con tripsina e identificó mediante marcado. Proteómica cuantitativa libre basada en LC-MS. Se identificaron y evaluaron trece proteínas utilizando una base de datos de secuencias 1789 de Ab β-lactamasas de UniProt, la mayoría de las cuales eran β-lactamasas de clase C (≥ 80 %). Es importante destacar que diferentes antibióticos, incluso los de la misma clase (por ejemplo, penicilina y amoxicilina), indujeron respuestas no equivalentes que comprenden varias isoformas de serina-β-lactamasas de clase C y D, lo que da como resultado resistomas únicos. Estos resultados abren la puerta a un nuevo enfoque para analizar y estudiar el problema de la resistencia a múltiples fármacos en bacterias que dependen en gran medida de la expresión de β-lactamasas.

Acinetobacter baumannii (Ab), un cocobacilo aerobio Gram-negativo, es uno de los patógenos de ESKAPE y actualmente está clasificado como una amenaza urgente para la salud pública por el CDC1. Esta clasificación se debe a la gravedad y alta mortalidad (en algunos casos superior al 50%) de las infecciones por Ac resistentes a carbapenem (CRAb)2,3,4,5,6,7,8. Además, estas infecciones generalmente son nosocomiales y ocurren con frecuencia en la unidad de cuidados intensivos (UCI; representando en algunos casos hasta el 31% de las infecciones de UCI en todo el mundo) donde los pacientes ya son más sensibles2,9,10,11,12.

Para desarrollar nuevas estrategias terapéuticas para combatir estos patógenos, se requiere una comprensión más profunda de sus mecanismos de resistencia. Por lo general, las bacterias utilizan una combinación de modificación de objetivos, regulación de entrada/salida, cambios metabólicos y desactivación de fármacos a través de la expresión de β-lactamasas, pero la contribución relativa de estas múltiples estrategias varía de un patógeno a otro7,13. Por ejemplo, aunque Ab y CRAb pueden expresar proteína de unión a penicilina modificada (PBP), generalmente no se considera como el mecanismo principal de resistencia a diferencia de Staphylococcus aureus resistente a la meticilina14. Con respecto específicamente a CRAb, los primeros estudios presentaron puntos de vista opuestos sobre la importancia relativa de las modificaciones y la regulación de PBP, con revisiones más recientes que sugieren que la producción de carbapenemasas tiende a ser el método más importante de resistencia para CRAb14,15,16. Las carbapenemasas, brevemente, son β-lactamasas que pueden hidrolizar carbapenemas además de otros antibióticos β-lactámicos. Ejemplos de estos se encuentran en las serina β-lactamasas de clase A y D y las metalo-β-lactamasas de clase B, con la serina β-lactamasa de tipo OXA de clase D que se detecta regularmente en CRAb17,18,19. Estudios previos también informaron que una variedad de tales β-lactamasas de tipo OXA se pueden encontrar en CRAb19; sin embargo, se ha realizado un trabajo limitado para intentar caracterizar selectivamente el conjunto completo de β-lactamasas en una sola cepa y compararlas con mutantes resistentes20,21,22,23.

Por lo tanto, catalogar y analizar la colección de estas enzimas puede ser un paso fundamental en el desarrollo de nuevas terapias combinadas en las que los inhibidores de la β-lactamasa se combinen con antibióticos β-lactámicos. Un informe reciente incluso demostró el uso de una nueva combinación de inhibidores de β-lactamasa en el tratamiento exitoso de un paciente que padecía una infección por Ab XDR. Sin embargo, dado que los inhibidores en sí mismos no son efectivos contra todas las clases, existe la posibilidad de que futuras mutaciones de la β-lactamasa puedan hacer que los inhibidores sean ineficaces24,25,26. La dificultad de esto radica en el hecho de que las bacterias resistentes a los medicamentos pueden portar múltiples copias de un gen de β-lactamasa, que no necesitan expresarse simultáneamente (o al menos no en la misma medida) para mantener un crecimiento celular eficiente. Por lo tanto, las bacterias pueden expresar colecciones únicas de β-lactamasas, lo que da como resultado resistomas específicos que no solo son de la clase de antibióticos (p. ej., β-lactámicos) sino que también dependen de moléculas. Además, se desconoce en qué medida estos resistomas retienen una "memoria" de la exposición anterior a los antibióticos o qué tan rápido pueden adaptarse a nuevos factores estresantes ambientales.

Para comprender la resistencia a los antibióticos en las bacterias y qué factores pueden influir en ella, muchos estudios han utilizado varios enfoques "-ómicos" para caracterizar los cambios genéticos (genómicos), transcripcionales (transcriptómicos), metabólicos (metabolómicos) y traslacionales (proteómicos) que pueden ocurrir. en bacterias como resultado de la administración de fármacos. Entre estas ómicas, la proteómica proporciona la información más directa sobre la respuesta bacteriana a estímulos externos, como el uso de antibióticos. Por lo tanto, muchos estudios recientes informan los perfiles proteómicos o proteomas de aislados clínicos resistentes a los medicamentos, así como bacterias con resistencia a los medicamentos que se indujo en el laboratorio20,27,28,29,30. Por lo general, se mide el proteoma completo y para mostrar la expresión diferencial de numerosas proteínas en varias bacterias resistentes a los medicamentos, incluidas las relacionadas con el metabolismo, el manejo de especies reactivas de oxígeno, los objetivos de los medicamentos, la modificación del ADN/ARN, etc. En el caso de los proteomas de cepas de Ab resistentes a los antibióticos, los investigadores observaron que la expresión de β-lactamasa generalmente estaba regulada al alza20,27,31,32. Sin embargo, aunque una pequeña cantidad de estudios han observado una correlación entre varios antibióticos y la expresión total de proteínas en Ab, no ha habido una investigación sistemática de la exposición específica a antibióticos (mismas clases o diferentes) en bacterias y sus respuestas enzimáticas específicas. En apoyo de dicho estudio, dos informes recientes identificaron específicamente el uso previo de antibióticos y la exposición a inhibidores de la β-lactamasa como factores de riesgo de infecciones por gramnegativos resistentes a los medicamentos5,33. Estos estudios e informes juntos sugieren que los genes, las proteínas, las estructuras de los medicamentos y sus funciones específicas están todos interconectados para desarrollar resistencia a los medicamentos. Por lo tanto, podríamos plantear la hipótesis de que las diferencias estructurales entre varios antibióticos β-lactámicos pueden ser importantes para diferentes respuestas de resistencia bacteriana en forma de patrones de expresión alterados de β-lactamasa.

En este documento, presentamos el estudio proteómico cuantitativo basado en LC-MS de la expresión de β-lactamasa de Ab (ATCC 19606; Ab19606) en respuesta a la exposición a varios antibióticos β-lactámicos. Esto se logró mediante la separación del sobrenadante libre de células del medio de crecimiento bacteriano utilizando SDS-PAGE, seguido de un análisis LC-MS-MS de la mezcla de proteínas.

Para determinar y caracterizar la resistencia a los betalactámicos en Ab19606, que se ha utilizado ampliamente como cepa de control en estudios relacionados con la resistencia a los antibióticos, se cultivó en caldo nutritivo con cuatro clases diferentes de antibióticos betalactámicos (10 µg/mL). Para confirmar que la resistencia fue inducida por la exposición repetida a β-lactámicos, se realizaron ensayos de difusión en disco en agar Mueller-Hinton (MH) (Fig. 1a). Se observaron colonias crecidas después de 24 h de incubación a 37 °C. En comparación con el ATCC 19606 sensible a los medicamentos de tipo salvaje, las regiones inhibitorias se redujeron para todos los antibióticos contra las cepas resistentes a los medicamentos: la ceftazidima (cefalosporina) y la piperacilina (penicilina) se redujeron en 5 mm y 6 mm, respectivamente, y el imipenem (carbapenem) y meropenem (carbapenem) se redujeron en 7 mm y 5 mm, respectivamente. Esto confirmó que Ab19606 podría generar una resistencia significativa a los betalactámicos frente a los antibióticos expuestos.

( a ) El ensayo de difusión en disco se realizó a través de la cepa Ab19606 de tipo salvaje y seleccionada por β-lactámicos para confirmar la resistencia inducida por el tratamiento con antibióticos. La resistencia inducida se determinó midiendo el tamaño del diámetro, y todas las resistencias se confirmaron mediante repeticiones por triplicado. ( b ) Esquema experimental de selección de antibióticos β-lactámicos y separación / preparación de muestras para el enfoque proteómico.

Para evaluar más a fondo el mecanismo de resistencia que se produce en estos organismos, Ab19606 se cultivó en caldo nutritivo y se sembró en placas de agar que contenían concentraciones subinhibitorias de varios antibióticos betalactámicos y no betalactámicos. Las colonias fueron seleccionadas y cultivadas en frascos de un litro de caldo nutritivo con una concentración de 5 μM del antibiótico correspondiente. Una vez que el cultivo alcanzó la fase estacionaria, las células se centrifugaron y el sobrenadante se concentró utilizando unidades de filtro centrífugo Ultra-15 (Fig. 1b).

Para verificar la presencia de enzimas β-lactamasas de las cepas Ab19606 seleccionadas con β-lactámicos, se utilizó como indicador colorimétrico nitrocefina, una cefalosporina cromogénica34,35. Inicialmente, este sobrenadante libre de células se comparó con el lisado celular para garantizar la presencia de β-lactamasas (Fig. S1 complementaria). Típicamente, se considera que solo las bacterias Gram-positivas excretan β-lactamasas al espacio extracelular36. Sin embargo, varias publicaciones han demostrado que bacterias Gram negativas, como Ab, también son capaces de hacerlo37,38,39,40,41,42. Esto está respaldado cualitativamente por nuestro experimento que demuestra la capacidad del sobrenadante libre de células para hidrolizar también la nitrocefina. Para todas las muestras concentradas de sobrenadante libre de células, se pudo detectar actividad enzimática y se pudieron obtener parámetros de actividad bioquímica (por ejemplo, Km, kcat) variando la concentración de nitrocefina de 0.01 a 75 μM (Tabla 1, Fig. S2 complementaria). Se usó una muestra de TEM-1 β-lactamasa purificada como control de cinética positivo. Los resultados aparentes de Km y kcat son comparables con los parámetros cinéticos de control de TEM-1, mostrando un rango razonable para kcat/Km43. Estos resultados sugieren que no solo estaban presentes las enzimas β-lactamasa en el sobrenadante sin células concentrado, sino que también se encontraban dentro de un rango de concentración adecuado y que podría procederse a una caracterización adicional.

Para visualizar y separar las β-lactamasas expresadas por Ab19606, en preparación para LC-MS, realizamos una separación en gel SDS de las muestras de sobrenadante altamente concentradas que provenían de muestras de Ab19606 después de 72 h de exposición a 5 μM de antibióticos (Fig. 2a). Se usó una β-lactamasa de clase A purificada (TEM-1, 29 kDa/línea 1) como línea de control positivo. Después de SDS-PAGE, las proteínas de d-lactamasa eran fácilmente visibles después de la tinción con azul de Coomassie. Varios carriles que contenían sobrenadantes recolectados de varias muestras Ab19606 expuestas a β-lactámicos (muestras 1–9) exhibieron una banda distinta en una ubicación correspondiente a un tamaño entre 27,5 y 42 kDa, correspondiente a la expresión de β-lactamasas. Curiosamente, la intensidad de las bandas fue variable y las bandas de gel de proteínas separadas mostraron diferentes patrones de proteínas y niveles de expresión según el antibiótico utilizado para inducir la resistencia.

( a ) SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie de muestras de sobrenadante sin células. La β-lactamasa TEM-1 purificada se usó como control. Se cortó la posible área de gel que contenía todas las clases de proteínas β-lactamasas (cuadrado rojo) para análisis proteómicos adicionales. (b) Proporciones relativas de β-lactamasas expresadas después de la exposición a antibióticos. ADC y AmpC son β-lactamasas de tipo C; OXA es tipo D; TEM es tipo A; La PBP es el objetivo de los antibióticos β-lactámicos, pero tiene similitudes estructurales y un peso molecular similar.

Después de la separación exitosa de las proteínas mediante electroforesis en gel SDS, se cortaron secciones del gel que contenían las proteínas β-lactamasa (regiones rojas en la Fig. 2a) para el análisis proteómico. Los experimentos de proteómica basados en LC-MS/MS se realizaron utilizando un método de proteómica sin etiquetas (MaxLFQ) para la identificación de las isoformas de β-lactamasa expresadas por las colonias resistentes a los medicamentos. Más concretamente, la preparación de las muestras se realizó mediante digestión tríptica y las muestras digeridas se analizaron mediante cromatografía líquida de alta resolución-espectrometría de masas (LC-MS/MS). Luego, los péptidos identificados se analizaron y evaluaron a través de Mascot, Proteome Discoverer y MSFragger utilizando un archivo FASTA que comprende la base de datos de secuencias de β-lactamasa Ab19606.

En todas las muestras, se identificaron varias secuencias que coinciden, con al menos 2 secuencias peptídicas únicas, con varias isoformas de β-lactamasa (Tabla 2). A continuación, se comparó la abundancia relativa de estas isoformas mediante la normalización de la intensidad sin marcador con la intensidad total medida para la muestra. Luego se agruparon varias proteínas, que pertenecen a una clase más grande, por ejemplo, OXA-51 y OXA-66 se combinan en un grupo OXA (Fig. 2b). Aunque también se identificaron varias proteínas no β-lactamasas a partir del análisis de proteómica, los tipos de proteínas más destacados fueron la ampicilinasa C (AmpC), la AmpC derivada de Acinetobacter (ADC) y la oxacilinasa (OXA), que pertenecen tanto a la clase C como a la D enzimas (Fig. 2b, Fig. S3 complementaria). Es importante destacar que la expresión de estas enzimas por Ab19606 concuerda con la presencia de los genes blaAmpC y blaOXA catalogados por la ATCC.44 Curiosamente, se observó que las cantidades relativas de estos tres tipos de proteínas β-lactamasas eran significativamente diferentes según el antibiótico a administrar. que Ab19606 fue expuesto. Estos datos sugieren que la expresión de β-lactamasas puede estar influenciada por el tratamiento antibiótico específico, especialmente en los casos en los que Ab19606 estuvo expuesto a concentraciones de antibiótico por encima de su MIC. Este concepto está respaldado por la observación de que estos perfiles de resistencia activa también son diferentes para los antibióticos de la misma clase. Por ejemplo, la penicilina G (penG), la amoxicilina (amox) y la piperacilina (pipa) son antibióticos betalactámicos de la clase de penicilina, pero producen respuestas bastante diferentes (Fig. 2b, Fig. S3 complementaria).

Los antibióticos le han dado a la humanidad una ventaja exitosa contra los patógenos durante el último medio siglo. Sin embargo, las mutaciones y la selección natural, combinadas con tiempos de generación rápidos y tamaños de población enormes, están dando ahora a los patógenos una ventaja decisiva45,46,47,48. Para recuperar la ventaja, es importante comprender mejor la relación entre la estructura y la función de los antibióticos y cómo los patógenos pueden evolucionar sistemáticamente para subvertirlos, de modo que se puedan diseñar nuevas estrategias de tratamiento.

Las bacterias han desarrollado constantemente resistencia a muchas de las clases de agentes antimicrobianos actualmente en uso. Algunas bacterias, como Ab, tienen una propensión a desarrollar altos niveles de resistencia a los medicamentos, por lo que se clasifican como extremadamente resistentes a los medicamentos (XDR) y pan resistentes a los medicamentos6,46,49,50. Por lo tanto, nuestra elección de Ab19606 y antibióticos β-lactámicos se basó específicamente en el hecho de que CRAb ahora se considera una amenaza prioritaria por los CDC, ya que hay pocos tratamientos disponibles una vez que se ha producido una infección1,46,51. Además, la resistencia a los carbapenémicos se encuentra a menudo en cepas que se consideran MDR o XDR50,52,53. Aunque Ab y CRAb, como muchas bacterias, tienen múltiples modos de resistencia a su disposición, algunos consideran que la desactivación de los β-lactámicos a través de la acción de las β-lactamasas puede ser el mecanismo más significativo54,55. Esto presenta varios desafíos ya que las β-lactamasas son numerosas, tienen una gran similitud, son fácilmente transferibles entre bacterias y mutan fácilmente para proporcionar una mayor actividad en entornos con recursos limitados. Sin embargo, consideramos que estas mismas características también podrían brindar la oportunidad de identificar las interacciones no específicas o no intencionadas de los antibióticos con las bacterias que dan como resultado la resistencia.

Nuestros hallazgos, presentados en la Fig. 2 y la Fig. S3 complementaria, demuestran la variabilidad en la expresión de β-lactamasa que puede ocurrir como resultado de la exposición a antibióticos. Es importante destacar que todos los antibióticos dieron como resultado perfiles de expresión que son significativamente diferentes de los del Ab19606 de tipo salvaje, que se encontró que expresaba predominantemente ADC. Las secuencias únicas podían identificar cada enzima y se usaron para la cuantificación MaxLFQ de la expresión de proteínas. Además, demostramos a través de la comparación de secuencias lado a lado que las enzimas ADC (A0A5C1K4D3) y AmpC (A0A009PJF4 a A0A8D6JWD9) son isoformas únicas (Fig. 3)56.

Comparación de secuencias múltiples de isoformas AmpC (A0A009PJF4 a A0A8D6JWD9) y ADC (A0A5C1K4D3) identificadas. El rojo indica que el residuo coincide con la secuencia de referencia (AmpC). La figura fue generada usando el programa prime que es el paquete de Schrodinger.

Los mapas de cobertura de estas y otras proteínas identificadas se proporcionan en la Fig. S4 complementaria. Curiosamente, las β-lactamasas de clase C, que incluyen AmpC y ADC, tuvieron una variabilidad muy alta entre las diversas muestras de Ab19606, pero parecen demostrar una dependencia de la subclase de β-lactámicos (Figura complementaria S5). Más específicamente, las muestras tratadas con carbapenem (especialmente meropenem e imipenem) expresaron la mayor cantidad de AmpC (A0A009KWD8) con una gran proporción de ADC. En consecuencia, las muestras tratadas con los betalactámicos derivados de la penicilina más comunes, como la penicilina G, la amoxicilina y la piperacilina, en general, dieron como resultado proporciones mucho mayores de AmpC (A0A0R4J6T7). Esta diferencia podría deberse a la incapacidad de las β-lactamasas de clase C para escindir los carbapenémicos, mientras hidrolizan fácilmente las penicilinas o las cefalosporinas14,17,57. Esto sugeriría que las bacterias tratadas con carbapenémicos se encuentran bajo un mayor estrés, lo que conduce a una mayor expresión de β-lactamasas y un mayor grado de mutación y mayor presencia de isoformas relacionadas.

Este mismo concepto parece extenderse a la expresión variable de las proteínas OXA y PBP, aunque no se observa una tendencia clara. Sin embargo, la expresión variable de OXA es importante, ya que estas β-lactamasas de clase D son carbapenemasas conocidas y están involucradas en la evolución de CRAb17,19,52. En nuestros datos, parece que todos los β-lactámicos de la clase carbapenem indujeron la expresión de OXA, con meropenem y faropenem dando como resultado la mayor cantidad relativa entre todas las muestras. No está claro por qué el imipenem no necesariamente siguió esta tendencia, o por qué la penicilina, la amoxicilina y la piperacilina tienen niveles diferentes pero menores de expresión de OXA.

La observación de estas diferencias iniciales entre las clases de β-lactámicos e incluso entre compuestos de la misma subclase es prometedora y sugiere una relación más compleja entre la estructura del antibiótico y el desarrollo de resistencia de lo que se informó anteriormente. Aún así, no está claro qué tan bien se pueden correlacionar estos estudios con la generación de resistencia in vivo, ya que la concentración del compuesto variará mucho in vivo y se verá afectada por la distribución, el metabolismo y el recuento bacteriano. Además, nuestro estudio no pudo tener en cuenta el efecto que las poblaciones polimicrobianas pueden tener sobre la resistencia debido a la transferencia de genes.

Mediante el uso de un método proteómico libre de etiquetas en el que se analizaron las β-lactamasas presentes en una solución sobrenadante libre de células, se observó que Ab19606 había producido diferentes perfiles de β-lactamasas para cada antibiótico β-lactámico que se aplicó. Estos resultados sugieren que el β-lactámico específico, ergo su estructura, puede afectar a las mismas bacterias de manera diferente, lo que sugiere que existe una relación más complicada entre la estructura/función del antibiótico y la generación de resistencia. Estudios futuros investigarán la posibilidad de que esta variación exista dentro de las clases, no sea aleatoria y si se pueden identificar tendencias dependientes de la concentración. La aclaración adicional de tales relaciones no solo ampliaría significativamente nuestra comprensión de los mecanismos de resistencia bacteriana, sino que también podría conducir a nuevas herramientas críticas para el diseño de antibióticos de próxima generación o terapias combinadas que posiblemente podrían permitir la inhibición o evasión de β- Resistencia basada en lactamasa.

Ab19606 se cultivó en caldo nutritivo a 37 °C durante la noche. El cultivo se diluyó a 0,5 estándar de McFarland (1,5 × 108 CFU/mL) y se esparcieron 100 μL en agar Mueller-Hinton. Se añadieron cantidades apropiadas de antibiótico a discos de 6 mm de acuerdo con el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI). Las placas se incubaron a 37 °C durante 18 h antes de determinar las zonas de inhibición. Para la exposición posterior, las bacterias se recogieron a lo largo de la zona de inhibición de un disco y se volvieron a cultivar en caldo nutritivo. Las células se prepararon de manera idéntica, sin embargo, cada placa de ensayo de difusión en disco solo tenía discos de antibiótico (3x) que coincidían con los del disco que creaba la zona de inhibición de la que se recolectaron las bacterias. Se llevaron a cabo ensayos posteriores hasta que aparecieron las mutaciones que permitieron que se produjera la resistencia, normalmente en 2 o 3 pases.

Ab19606 se cultivó a 37 °C en caldo nutritivo durante la noche y se diluyó a 0,5 estándar de McFarland (1,5 × 108 CFU/mL). Para inducir la expresión de β-lactamasas, los cultivos de Ab19606 se extendieron en placas de agar nutritivo que contenían concentraciones subinhibitorias de antibiótico para el aislamiento de colonias mediante el método de estrías y se incubaron a 37 °C durante 24 h. Luego se seleccionaron las colonias y se cultivaron, con agitación, a 37 °C durante 72 h en 1 L de caldo nutritivo con 5 μM del mismo antibiótico que se usó para la selección.

Los cultivos de un litro descritos anteriormente se utilizaron para analizar la producción de β-lactamasa inducida por el antibiótico presente en el medio. Después de 72 h de incubación, los medios se centrifugaron dos veces (8000 x g, 10 min). Filtramos el sobrenadante clarificado a través de un filtro de jeringa de 0,2 μm para eliminar cualquier patógeno bacteriano restante. A continuación, todo el sobrenadante se concentró utilizando unidades de filtro centrífugo Millipore Sigma Ultra-15 con un límite de 10 kDa (Nº de catálogo UFC901008).

TEM-1 se expresó en Escherichia coli BL21 (DE3) con el vector pET-TEM-1, se extrajo por choque osmótico y se purificó por cromatografía quelante de Zn y filtración en gel (sephacryl-100). Para el almacenamiento se utilizaron Tris 50 mM, pH 8,0 y NaCl 150 mM.

La actividad de TEM-1 y β-lactamasas purificadas en el sobrenadante se determinó espectrofotométricamente (lector Spectramax-M5) a temperatura ambiente en tampón de fosfato de potasio 50 mM (pH 7,0) que contribuye a la estabilidad de la enzima a estos volúmenes en un volumen total de 100 µl en las condiciones con nitrocefina (ε486 nm = 20.500 M−1 cm−1) como sustrato informador. La nitrocefina (0,001 a 100 μM) se preparó recientemente en tampón de potasio 50 mM (pH 7,0). Los valores aparentes de Km y kcat se derivaron de al menos cuatro mediciones de velocidad inicial independientes mediante la aplicación de un ajuste de regresión no lineal con el modelo de cinética enzimática de Michaelis-Menten en GraphPad Prism 9.

Las muestras de sobrenadante concentrado (7,5 μl) se mezclaron en tubos de microcentrífuga de 1,5 ml con tinción de tampón Laemmli 2 ×, Bio-Rad (2,5 μl). Las muestras se calentaron en un baño de agua durante 10 min a 100 °C y luego se centrifugaron (12.000 rpm, 10 min). Las proteínas en el sobrenadante de patógenos bacterianos seleccionados con antibióticos se separaron mediante gel de resolución Novex Tris-glicina de gradiente al 10% SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.). Después de la separación por electroforesis a 130 V durante 1 h, el gel se fijó en MeOH al 50 %, HoAC al 10 %, H2O al 40 % durante 20 min. Los geles se colocaron en una bandeja de plástico que contenía un volumen apropiado (100-250 ml) de solución de tinción (0,25 % Coomassie Blue R-250) hasta que el gel adquirió un color azul uniforme. La tinción se completó cuando el gel ya no era visible en la solución de colorante. Para desteñir el gel, se utilizaron MeOH al 5 % y HoAC al 7,5 % en dH2O al 87,5 % hasta que el fondo era transparente. Los geles se almacenaron en HoAC al 7%.

Para la digestión de proteínas, las bandas se cortaron para minimizar el exceso de poliacrilamida, y se dividieron en varias piezas más pequeñas. Las piezas de gel se lavaron con agua y se deshidrataron en acetonitrilo. A continuación, las bandas se redujeron con DTT y se alquilaron con yodoacetamida antes de la digestión en gel. Todas las bandas se digirieron en gel usando tripsina, agregando 5 μL 10 ng/μL de tripsina o quimotripsina en bicarbonato de amonio 50 mM e incubando la digestión durante la noche a temperatura ambiente para lograr una digestión completa. Los péptidos que se formaron se extrajeron de la poliacrilamida en dos alícuotas de 30 μL de acetonitrilo al 50 % con ácido fórmico al 5 %. Estos extractos se combinaron y evaporaron a < 10 μL en Speedvac y luego se resuspendieron en ácido acético al 1 % para obtener un volumen final de ~ 30 μL para el análisis LC-MS. El sistema LC-MS era un sistema de espectrometría de masas Bruker TimsTof Pro2 Q-Tof que funcionaba en modo de iones positivos, junto con una fuente de iones CaptiveSpray (ambos de Bruker Daltonik GmbH, Bremen). La columna de HPLC era una columna de cromatografía capilar de fase inversa C18 ReproSil AQ, 1,9 μm, 120 Å Bruker de 15 cm x 75 μm de d.i. Se inyectaron volúmenes de un μl del extracto y los péptidos eluidos de la columna mediante un gradiente de acetonitrilo/ácido fórmico al 0,1 % a un caudal de 0,3 μl/min se introdujeron en la fuente del espectrómetro de masas en línea. Los productos de digestión se analizaron utilizando un método DDA de acumulación paralela-fragmentación en serie para seleccionar los iones precursores para la fragmentación con un escaneo TIMS-MS seguido de 10 escaneos PASEF MS/MS. El barrido topográfico TIMS-MS se adquirió entre 0,60 y 1,6 Vs/cm2 y 100–1700 m/z con un tiempo de rampa de 166 ms. El tiempo de ciclo total para los escaneos PASEF fue de 1,2 s y los experimentos de MS/MS se realizaron con energías de colisión entre 20 eV (0,6 Vs/cm2) y 59 eV (1,6 Vs/cm2). Se seleccionaron precursores con 2 a 5 cargas con el valor objetivo establecido en 20 000 au y el umbral de intensidad en 2500 au. Los precursores se excluyeron dinámicamente durante 0,4 s. Los datos se analizaron utilizando todos los espectros CID recopilados en el experimento para buscar en una base de datos Ab compilada utilizando Uniprot utilizando el programa MSFragger. Los parámetros para esta búsqueda incluyen una precisión de masa precursora de 20 ppm y una precisión de masa de fragmento de 0,05 Da, péptidos completamente trípticos con dos escisiones perdidas permitidas, metionina oxidada y acetilación N-terminal de proteína como modificaciones variables y carbamidometilación como modificación estática. La identificación de proteínas y péptidos se validó al 1 % de FDR utilizando una estrategia de base de datos señuelo.

Nuestro método de alineación de secuencias se utilizó para la búsqueda en la base de datos de una manera sencilla. Las múltiples herramientas de alineación de secuencias en el paquete Schrodinger ver. 2019-3 basado en el algoritmo clásico de Smith-Waterman. La base de datos de secuencias de comparación fue proporcionada por UniProt y NCBI Protein Data Bank.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable. Además, los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en ProteomeXchange Consortium a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD042336.

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El apoyo a la investigación para Woo Shik Shin fue proporcionado por la Facultad de Farmacia de la Universidad Médica del Noreste de Ohio. El Departamento de Ciencias Farmacéuticas de la Universidad Médica del Noreste de Ohio proporcionó todos los recursos de investigación necesarios.

Este trabajo fue apoyado por subvenciones de los Institutos Nacionales de Salud (1R01AG076699 para Woo Shik Shin) y una subvención inicial de investigación traslacional/de puesta en marcha de la Universidad Médica del Noreste de Ohio.

Estos autores contribuyeron por igual: Trae Hillyer y Bogdan M. Benin.

Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Médica del Noreste de Ohio, Rootstown, OH, EE. UU.

Trae Hillyer, Bogdan M. Benin, Noah Aguirre y Woo Shik Shin

Departamento de Neurología, Universidad de California, Los Ángeles, CA, EE. UU.

Sol Chuanqi

Núcleo de Proteómica y Metabolómica, Instituto de Investigación Lerner, Clínica Cleveland, Cleveland, OH, EE. UU.

belinda willard

Departamento de Biología y Fisiología Integrativas, Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE. UU.

Yuk Yin farsa

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TH y NA cultivaron muestras Ab19606 y prepararon muestras para proteómica. BW realizó mediciones proteómicas e identificación de péptidos. CS purificó y proporcionó la proteína de control TEM-1. BMB analizó los resultados. BMB y WSS escribieron el manuscrito. WSS supervisó el trabajo. WSS y YYS diseñaron el proyecto. TH y BMB contribuyeron igualmente a este trabajo. Todos los autores discutieron los resultados y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Woo Shik Shin.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Reimpresiones y permisos

Hillyer, T., Benin, BM, Sun, C. et al. Una nueva estrategia para caracterizar el patrón de resistencia a fármacos inducida por antibióticos β-lactámicos en Acinetobacter baumannii. Informe científico 13, 9177 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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Recibido: 08 diciembre 2022

Aceptado: 04 junio 2023

Publicado: 06 junio 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-36475-9

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